4種天然產物對福壽螺肝臟和頭足酶活性的影響

岑小鳳，李晶晶

（廣西衛健委全生命周期健康與保健研究重點實驗室/廣西環境暴露組學與全生命周期健康重點實驗室/桂林醫學院公共衛生學院，廣西 桂林 541199）

【研究意義】福壽螺（Pomacea canaliculata）隸屬于瓶螺科（Ampullariidae）福壽螺屬，原產于南美洲亞馬遜河流域，是世界性惡性入侵物種[1]。在2003 年被我國國家環?？偩謱⑵淞腥胧着肭治覈?6 種外來物種的“黑名單”[2]。福壽螺取食容易，導致田間水稻幼苗死亡，并因其繁殖快、繁殖量大等特點給水稻等農作物種植和生態環境帶來嚴重危害和影響[3-4]。除此之外，福壽螺還是人類廣州管圓蟲（Angiostrongylus cantonensis）自然感染或實驗室感染的中間宿主，該線蟲的幼蟲能侵犯人體中樞神經系統，引發嗜酸性粒細胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎[5-6]。關于福壽螺的防治方法主要有物理防治、化學防治以及生物防治法[7]，化學防治仍是主要的防治手段，但缺乏安全性好、殺螺效果佳的防螺藥物。雖有較多的文獻報道植物提取物對福壽螺的殺滅效果，但較少研究涉及其有效成分對福壽螺的殺螺活性和作用機制的研究[8]?！厩叭搜芯窟M展】目前，對植物源殺螺劑的作用機理研究主要集中在酶活性方面，包括能量代謝相關酶、轉氨酶、神經信號傳導酶、磷酸酶以及氧化應激相關酶[9-15]。近年來，蛋白組學和轉錄組學技術被用于研究福壽螺的抗藥機制和免疫保護機制。牟希東等[16]利用iTRAQ 蛋白質組技術發現，殺螺劑四聚乙醛會引起氨基酸、賴氨酸等代謝紊亂、破壞細胞結構組成和肌肉收縮，引起免疫應答，造成細胞凋亡和神經毒性。Yu等[17]通過蛋白組學分析表明，齊墩果酸的脅迫導致福壽螺肝臟葡萄糖代謝、能量合成和蛋白質合成的中斷，并觸發了一系列分子通路，其中包含許多參與免疫過程的關鍵蛋白。Xiong等[18-20]利用轉錄組學技術分析發現，脂多糖干預后福壽螺氧化反應和解毒作用相關基因表達的顯著上調。槲皮素（quercetin）、木犀草苷（luteoloside）、芹菜素（apigenin）和香草酸（vanillic acid）均為多酚類化合物，在植物中含量豐富。國內外對這4種化合物的生物活性研究主要在抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗菌、抗炎和抗氧化等藥理活性[21-24]?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究[25]中筆者首次報道了白肉榕葉乙醇提取物對福壽螺的毒殺活性，以及牛耳楓葉甲醇提取物的抑菌活性和殺蟲活性，并從上述兩種提取物中分離鑒定出包括香草酸、芹菜素、槲皮素和木犀草素[26-27]在內的10余種化合物。然而，除槲皮素外，這些化合物對福壽螺的毒殺作用至今未見研究報道，其殺螺作用機理仍不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究旨在研究槲皮素、木犀草苷（木犀草素衍生物）、芹菜素和香草酸脅迫對福壽螺的存活率，福壽螺肝臟中谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）、谷草轉氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST/GOT）活性，福壽螺頭足中乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、一氧化氮合酶（nitric oxide sythase，NOS）活性的影響，并通過RT-qPCR 技術測定福壽螺肝臟和頭足中相關基因的表達量，初步探討其作用機理，以期從中尋找具有開發潛力的植物源殺螺劑先導化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試福壽螺：采自廣西農業科學院桂北分院桂林市農業科學院。采集的福壽螺用自來水清洗干凈其表面后，投放入到裝有去氯水的容器中，于室溫（25±2）℃，濕度（60%±5%）條件下飼養7 d后，選用螺殼表面無損傷、大小一致的福壽螺用于試驗研究。

試劑及儀器：芹菜素、香草酸、槲皮素和木犀草苷標準品，純度均≥98%，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；茶皂素原粉（60%），中國農科院茶葉研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型），碧云天生物技術有限公司；ALT/GPT 試劑盒、AST/GOT 試劑盒、AChE 試劑盒、NOS 試劑盒購于南京建成生物工程中心；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）以及原肌球蛋白（tropomyosin，TM）引物，廣州維伯鑫生物科技有限公司；Trizol Reagent，美國ambion 公司；Thermo RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit、ABI PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix，美國Thermo Fisher Scientific 公司；其余試劑為國產分析純。101A-1E 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海實驗儀器有限公司；L600臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Varioskan LUX User Manual Chinese 酶標儀、NanoDrop 2000、實時熒光定量PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，上海精科天美科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 4 種天然產物溶液的配置 分別準確稱取一定量的槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸，用適量甲醇溶解后加入去氯水配制成100 mg/L 的溶液（甲醇含量不超過2%），以相同含量的甲醇去氯水做空白對照。

1.2.2 福壽螺室內毒殺活性測定 參照WHO 室內藥劑浸泡法[28]，選擇口徑大小相近的福壽螺，隨機分為6組，分別為空白組、茶皂素組（對照藥劑）、槲皮素組、木犀草苷組、芹菜素組和香草酸組。用燒杯盛放500 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入菜葉作為其食物，杯口用紗布封口以防其逃逸。施藥后24 h觀察和記錄福壽螺死亡情況。實驗開始時首先挑選出已經明顯開口死亡的福壽螺個體，對于一直都緊閉螺殼的福壽螺個體，可以選擇洗去表面藥物后放于清水中，浮上水面或者懸浮于水中30 min 后，用鑷子尖端輕輕插進厴甲與螺殼間隙無任何反應的則為死螺[28]。觀察后及時記錄福壽螺的死亡個數，并計算福壽螺的校正死亡率。

1.2.3 福壽螺肝臟和頭足酶活性的測定 在藥劑處理24 h后隨機取6只活福壽螺，去殼后取出福壽螺的肝臟和頭足部分，用濾紙吸干福壽螺組織表面的水分，存置于-80 ℃儲存備用。分別稱取0.5 g福壽螺肝臟和頭足組織，按福壽螺組織質量1∶9 的比例，加入0.9%的生理鹽水，肝臟組織用微量電動勻漿器于4 ℃勻漿，頭足組織采用20 mL 玻璃器研磨，將兩者待測組織勻漿離心分離（4 ℃，3 500 r/min，15 min），然后取上清液采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定福壽螺肝臟和頭足中蛋白質濃度，參照試劑盒說明書分別測定福壽螺肝臟中的ALT/GPT、AST/GOT的酶活性，以及頭足中AChE、NOS的酶活性。

1.2.4 福壽螺肝臟和頭足中基因相對表達量的測定 參照Trizol 操作說明書提取福壽螺組織中的RNA，然后用NanoDrop 2000 測定RNA 的濃度和純度，使用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，作為RT-qPCR 模板。設計特異性引物，選擇a-tubulin 作為內參基因，每個樣品的內參及目的基因做3 個復孔。RT-qPCR 反應體系為：1 μL cDNA 模板，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），SYBR Green Master Mix 12.5 μL，dd 水10.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應程序：50 ℃初始變性2 min，95 ℃變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共40 個循環。相對定量采用2-△△Ct法，其中△△Ct＝（Ct目的基因，槲皮素組-Ct內參基因，槲皮素組）-（Ct目的基因，空白組-Ct內參基因，空白組）。

1.3 數據分析

采用Excel 2010 和SPSS 25.0 進行數據處理和統計分析。計量資料使用“平均數±標準差”表示。多組間采用One-Way ANOVA 進行差異分析，方差檢驗齊性用LSD 法，方差不齊性用Games-Howell 法檢驗；兩組間采用獨立樣本T檢驗。以P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 4種化合物對福壽螺的毒殺作用

槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸處理后的福壽螺死亡情況見表2。在100 mg/L 濃度下，處理24 h后，槲皮素的殺螺活性最好，福壽螺死亡率達到45%，其次為木犀草苷27.3%和芹菜素23.5%，最后為香草酸12.0%。

表2 4種化合物對福壽螺死亡率的影響Tab.2 Effects of four compounds on the mortality rate of P.canaliculata

2.2 4種化合物對福壽螺肝臟兩種轉氨酶活性的影響

如圖1所示，與空白相比，槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸處理后，福壽螺肝臟中的ALT/GPT 酶活性均顯著下降（P＜0.05），分別降低了72.9%、58.9%、66.8%、66.5%。而福壽螺肝臟中AST/GOT 酶活性均顯著高于空白組（P＜0.05），分別升高了115.5%、103.8%、70.5%和88.2%。

圖1 4種化合物對福壽螺肝臟ALT/GPT（A）、AST/GOT（B）酶活性的影響Fig.1 Effects of four compounds on the activities of ALT/GPT（A）and AST/GOT（B）in the liver of P.canaliculata

2.3 4種化合物對福壽螺頭足兩種酶活性的影響

槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸處理后，與空白相比，福壽螺頭足中AChE 酶活性分別下降了43.9%、29.6%、24.8%和42.2%，均顯著低于空白組（P＜0.05）。福壽螺頭足中NOS 酶活性顯著下降（P＜0.05），分別比空白組降低了55.9%、38.8%、37.9%和30.2%（圖2）。

圖2 4種化合物對福壽螺頭足AChE（A）、NOS（B）酶活性的影響Fig.2 Effects of four compounds on the enzyme activities of AChE（A）and NOS（B）in the head-foot of P.canaliculata

2.4 槲皮素處理后福壽螺肝臟SOD、CAT、IDH的mRNA相對表達量

如圖3所示，與空白組相比，槲皮素處理下福壽螺肝臟中SOD、CAT的相對表達量顯著升高（P＜0.05），而IDH的相對表達量顯著降低（P＜0.05）。

圖3 槲皮素對福壽螺肝臟SOD、CAT、IDH相對表達量的影響Fig.3 Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and IDH in the liver of P.canaliculata

2.5 槲皮素處理后福壽螺頭足SOD、CAT、TM的mRNA相對表達量

圖4可見，槲皮素處理后，與空白組相比，福壽螺頭足中SOD的相對表達量顯著升高（P＜0.05），而TM的相對表達量顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對福壽螺頭足SOD、CAT、TM相對表達量的影響Fig.4 Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and TM in the head-foot of P.canaliculata

3 討論與結論

肝臟是福壽螺解毒的重要器官，其解毒過程涉及到ALT/GPT和AST/GOT這兩種重要的轉氨酶，這兩種轉氨酶與蛋白質代謝密切相關[29]。其中ALT/GPT 還涉及能量產生的相關途徑，尤其是三羧酸循環，AST/GOT 酶活性的高低與肝細胞損傷嚴重程度呈正相關[30]。本研究中經槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸4種天然產物處理后，福壽螺肝臟中ALT/GPT 酶活性均顯著降低，而福壽螺肝臟中AST/GOT 活性均顯著升高。其趨勢與魚腥草生物堿[31]、白頭翁皂苷[32]和檳榔堿[33]對釘螺的殺螺實驗結果一致。說明4 種化合物可能通過影響福壽螺肝臟的蛋白質和能量代謝而致其死亡。

福壽螺頭足位于螺體的前端，集中著大量的神經元，是最先接觸到藥液的組織，也是受損最嚴重的部位。乙酰膽堿是生物體中重要的神經遞質，AChE 作為水解乙酰膽堿的一種酶，在頭足表皮分布較多[7]，主要參與神經遞質傳遞和物質代謝，是神經細胞功能和性質的重要指標。在銀杏葉提取物[33]、檳榔堿[34]，以及氯硝柳胺[35]、滅螺酯[36]等化學殺螺劑處理釘螺后，觀察到AChE活性下降。本研究發現，經過4種天然產物處理后，福壽螺頭足的AChE 活性明顯降低，而AChE 活性降低將會導致水解乙酰膽堿的速度減慢，乙酰膽堿在突觸間隙堆積，此時突觸后膜會持續性興奮，導致福壽螺的頭足麻痹，外周神經和以神經為主的腺體生理功能紊亂，最終造成螺的死亡[14,37]。

NO 是一種新型神經遞質，可作為信號分子參與軟體動物的運動調節，是生物體內常見的第二信使[35,38]，而NOS 是催化NO 生物合成的唯一限速酶，研究表明[39]，當NOS 活性降低時，NO 合成受阻，神經傳遞受到抑制。本研究結果顯示，經過4種天然產物處理后，福壽螺頭足中NOS活性下降，與李洪軍[40]等使用氯硝柳胺懸浮劑對釘螺的浸殺實驗發現NOS 活性受到抑制的結果一致。表明4種天然化合物可能通過干擾神經遞質的傳遞，降低福壽螺肌肉運動能力，使福壽螺頭足不能閉合，以增加福壽螺與藥劑的接觸面積，最終導致福壽螺個體的死亡。

課題組研究發現槲皮素對福壽螺存活率和酶活性的影響最為明顯，因此對槲皮素的殺螺作用機制開展進一步研究。SOD 和CAT 可以防止活性氧自由基對機體中生物大分子的氧化損傷，對清除氧化脅迫過程中產生的活性氧自由基起著決定性作用[41]，SOD、CAT活性的改變，可以反映生物體在不同脅迫條件下的生理狀況[42]。IDH 是三羧酸循環中的限速酶[43]，TM 能調控肌鈣蛋白復合物和肌動蛋白之間的相互作用，起到調節肌肉收縮的作用[44]。本研究RT-qPCR 檢測結果顯示，經槲皮素處理后，福壽螺肝臟和頭足中的SOD、CAT 的mRNA 表達上調，而肝臟中IDH 和頭足中TM 的mRNA 表達水平降低。表明槲皮素能引起福壽螺的氧化應激反應，影響福壽螺正常能量代謝和肌肉運動功能。

天然活性化合物庫的分子結構多樣性是新藥物開發的源泉。據統計，目前已確定具有生物活性的天然產物在20 萬種以上，其中有生物活性的植物天然產物有10 萬種，占所有天然產物的一半[45]。植物源殺螺藥物具有低毒、易降解等優點，利用植物次生代謝產物成功防治有害生物的例子很多，如印楝素、魚藤酮、煙堿等植物源農藥已市場化很多年，在田間廣泛使用。然而，目前已成功推廣應用的植物源殺螺藥物極少，研究與開發新的植物源殺螺劑，具有極其廣闊的市場前景。槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸是廣泛存在于植物的根、莖、葉中。在前期篩選的植物中，白肉榕和牛耳楓都具有開發成為植物源農藥的潛力，筆者從中分離出了與這些植物防治效果一致的活性化合物，開發高效安全的殺螺藥物可能性很大。

綜上所述，本研究結果表明槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸可以降低福壽螺肝臟中ALT/GPT 的活性，升高AST/GOT 的活性，影響福壽螺肝臟組織的正常生理功能；同時抑制福壽螺頭足神經系統中AChE、NOS的酶活性，影響福壽螺頭足的正常神經遞質傳導。RT-qPCR 測定結果表明，經槲皮素處理后福壽螺肝臟中SOD、CAT 酶的mRNA 表達量和頭足中SOD 酶的mRNA 表達量上升，肝臟中IDH 酶和頭足中TM 的mRNA 表達量下降。這些為4種天然產物在防治福壽螺方面的應用提供了一定的實驗依據，但其具體作用機制仍有待進一步研究。