原發性開角型青光眼房水中EPO、Sema3A、TGF-β1與視網膜纖維層厚度、視野缺損的相關性研

王丹 陳云珍 閆楠

原發性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是一種常見的視神經退行性疾病,是導致眼盲的重要原因之一,主要表現為視網膜神經纖維層缺損和視野缺損。其發病機制尚不明確,主要與視網膜神經節細胞凋亡導致眼內壓增高有關。眼內微循環失調導致視乳頭血流灌注不足和局部缺血是引起視神經病變的重要原因[1,2]。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是紅細胞生成過程中重要的糖蛋白,眼部缺氧是紅細胞生成素與其受體結果促進紅細胞釋放的重要原因;信號素3A(semaphorin3A,Sema3A)是一種多功能蛋白,在視網膜發育、神經細胞軸突形成、血管發生中具有重要作用;轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種多功能生長因子,在多種細胞生長、凋亡、修復等過程發揮作用,但三者在POAG患者病情評估的報道較少[3,4]?；诖?本項研究擬以本院156例POAG患者為研究對象,檢測不同視野缺損程度患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平,分析其水平變化與患者視網膜纖維層厚度及視野缺損的關系,旨在為預防POAG患者病情進展提供指導依據。

資料與方法

一、一般資料

前瞻性病例對照研究。選取本院2019年6月至2020年6月期間收治的156例(156只眼)POAG患者作為觀察組,并選取同期進行手術的78例(78只眼)白內障患者作為對照組。對照組納入標準:(1)白內障患者術后視力校正0.6以上,屈光度±2.50D、試盤比<0.6,雙眼試盤差<0.2;(2)無青光眼相關癥狀(視乳頭損害、視網膜神經纖維層損害、視野缺損等);(3)常規視野檢測結果正常;(4)無青光眼疾病家族史及其它內眼或視神經疾病。

POAG觀察組根據患者視野缺損程度將患者分為A組(視野平均缺損程度≤-6 dB)55例、B組(視野平均缺損程度在-6 dB～-12 dB之間)66例和C組(視野平均缺損程度≥-12 dB)35例。觀察組納入標準:(1)青光眼患者符合全國青光眼學組提出的診斷標準[5],眼壓>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)、青光眼性視乳頭損害和視網膜神經纖維層損害,或青光眼性視野缺損和前房角開放或全部符合即可確診為POAG[6];(2)初次就診;(3)無青光眼家族史;(4)患者知情且簽署知情同意書。排除標準:(1)合并眼部外傷或內眼手術史者;(2)合并心血管系統或免疫系統疾病者;(3)合并視網膜和神經病變者;(4)無法進行光學相干斷層檢查者;(5)服用過免疫相關藥物者。研究獲醫院倫理委員會批準。

二、方法

入院時搜集患者性別、年齡、血壓、心率等資料,然后進行全面眼科檢查,測量眼壓、眼軸、前房深度及角膜中央厚度等,然后進行視野檢查和相干光層析成像術(optical coherencetomography,OCT)檢查。術中取房水標本保存待測。

三、觀察指標

1. 一般資料比較:組間分析比較POAG患者和白內障患者性別、年齡、眼軸、眼壓、視野平均缺損、杯盤比等一般資料情況。

2.2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平:于手術中進行房水標本采集,使用一次性無菌注射器于透明角膜緣穿刺進入前房,緩慢抽取房水樣本50～100 μl,嚴格按照無菌操作原則,注入0.5 ml高壓滅菌的Eppendorf管中并作標記,置于-80 ℃冰箱避光保存。采用酶聯免疫吸附實驗法檢測房水中EPO水平。取房水樣本,用二喹啉酸試劑盒測定蛋白濃度,取20 μl蛋白濃度房水加入聚丙烯酰胺凝膠中,進行電泳。然后置于硝酸纖維素膜,以5%脫脂牛奶室溫下封閉硝酸纖維素膜于4 ℃孵育2 h,加入稀釋好的一抗,過夜,加入稀釋的辣根過氧化物酶二抗,室溫孵育2 h。以β-catin作為內參,凝膠成像顯影獲得Sema3A蛋白條帶,以蛋白條帶的灰度值計算Sema3A表達量。使用美國R&DSystems公司試劑盒,采用酶聯免疫雙抗體夾心法檢測房水中TGF-β1水平,設置標準曲線,將待測品孔每孔中加入房水樣本,并設置2個復孔,于室溫下反應2 h,以PBS洗滌5次,每孔加入一抗,于室溫孵育1 h,洗滌5次,加入二抗,于室溫孵育1 h,清洗反應板,加入底物液,室溫避光反應10 min,加入終止液,使用芬蘭Thermo公司酶標儀測定波長450 nm處吸光度值。

3.組患者視網膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較:觀察組患者于入院就診時采用全自動視野機進行視野檢查,設置為24-2中心視野的閾值檢測程序,以SIT A-Fast統計分析并計算視野平均缺損程度,使用紅外攝像儀自動監測受檢眼的固視狀態。白內障患者于術后第2周復查時進行視野檢查。使用OCT(ZEISS,德國)進行視網膜纖維層厚度檢查,以視乳頭為掃描中心,掃描參數為:波長840 mm,橫向分辨率15 μm,軸向分辨率5 μm,深度2 mm,直徑3.45 mm,長度 12 mm,自動獲取視盤周圍視網膜纖維層厚度,信號強度40分以上清晰圖像為檢查結果,檢查均由同一名經驗豐富的醫師完成。然后進行組間分析比較。

4.房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度及視野缺損程度的相關性分析:采用arson相關性分析房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平變化與視網膜纖維層厚度及視野缺損程度的關系。

四、統計學分析方法

結 果

一、 一般資料比較

2組患者性別、年齡、眼軸等資料差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性;而觀察組患者眼壓、視野平均缺損、杯盤比顯著高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 一般資料比較

二、 2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比較

觀察組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平顯著高于對照組,且觀察組中B組和C組房水中EPO、GF-β1水平高于A組,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平比較

三、 2組患者視網膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較

觀察組患者視網膜纖維層厚度顯著低于對照組,且觀察組中B組和C組視網膜纖維層厚度低于A組,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05);觀察組患者視野平均缺損程度顯著高于對照組,且觀察組中B組和C組視野平均缺損程度顯著高于A組,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者視網膜纖維層厚度及視野平均缺損程度比較

四、房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度及視野缺損的相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示,房水中EPO水平與視網膜纖維層厚度呈負相關關系(r= -0.348,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關關系(r=0.518,P<0.05);房水中Sema3A水平與視網膜纖維層厚度呈負相關關系(r= -0.426,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關關系(r=0.629,P<0.05);房水中TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度呈負相關關系(r=-0.457,P<0.05),與視野缺損程度呈正相關關系(r=0.532,P<0.05)。見表4。

表4 房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度及視野缺損的相關性分析

討 論

POAG因早期無明顯癥狀,不易發生,具有較高潛在風險。臨床以OCT檢查測量視網膜纖維層厚度幫助早期診斷,但對無視野缺損患者存在一定爭議,影響其應用[7,8]。尋找可評估POAG患者視網膜纖維層厚度和視野缺損程度的生物學指標,幫助早期診斷及治療是目前臨床重點關注的內容[9,10]。POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1顯著升高,且其水平隨視網膜纖維層厚度的變薄,視野缺損程度的加重而逐漸升高,可為預防POAG病情進展提供重要參考。

本次研究結果顯示:觀察組患者眼壓、視野平均缺損、杯盤比顯著高于對照組(P<0.05),說明POAG的發生與患者眼壓、視野缺損及杯盤比有關。究其原因,青光眼主要與視網膜神經節細胞及軸突丟失導致盤沿、視乳頭心態凹陷、視網膜纖維層厚度改變,進而導致視野缺損,甚至失明[11,12]。當視網膜神經節細胞丟失30%時視功能損害,隨著丟失數量的升高,損害程度加重。視網膜神經節細胞丟失,刺激眼壓升高,眼內微循環改變,眼部缺氧導致視神經病變,進而參與青光眼疾病進展[13,14]。并且,觀察組患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平和視野缺損顯著高于對照組,而視網膜纖維層厚度低于對照組,說明POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平顯著升高,視野缺損程度加重,視網膜纖維層變薄,而隨著視野缺損程度的不斷加重,視網膜纖維層逐漸變薄,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平逐漸升高,提示房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度和視野缺損程度密切相關。Pearson相關性分析結果顯示,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視網膜纖維層厚度呈負相關關系,與視野缺損程度呈相關關系。上述結果提示:可通過檢測POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平了解患者視網膜纖維層厚度變化情況及視野缺損程度情況,進而為早期診斷及治療提供依據。這可能是因為局部缺氧誘導虹膜血管異常新生,纖維血管膜收縮,刺激眼內壓升高,導致小梁網粘黏,房水無法正常排出,加重眼壓,進而影響視神經[15,16]。EPO是促進血管生成的糖蛋白激素,視網膜損害時EPO可通過刺激紅系祖細胞分化、增生,促進神經血管生長,保護患者視網膜神經節細胞免受損傷。局部缺氧時,視乳頭血流灌注不足及局部缺血,細胞內過氧化氫含量減少會促進紅細胞生成,進而導致EPO水平升高,其水平升高時可促進新生血管生成,致使眼壓升高。同時,EPO升高還會引起虹膜組織黏連,影響血流動力學,進而導致眼部微循環失調,導致視野缺損,影響視功能[17,18]。Sema3A對視網膜發育、神經細胞軸突形成、血管發生產生具有較好調控作用,通常在缺血缺氧環境下發揮作用?？赏ㄟ^與受體神經纖毛蛋白1結合介導促血管新生,阻礙視網膜血管重建,同時進一步加重缺氧,還可通過破壞內皮細胞的緊密連接,促進視網膜血管閉塞和缺氧,進而刺激血管異常新生,加重小梁網阻塞,最終促使眼壓升高[19,20]。TGF-β1是一種具有多種生物活性的多肽類生長因子,在細胞生長、分化、凋亡及免疫調節、細胞外基質合成等過程發揮重要功能。TGF-β1可通過刺激成纖維細胞的增殖來加固新生血管結構,還可作用于小梁網,導致房水流出減少,進而直接導致眼壓升高,參與青光眼進展過程[21]。因此,房水中EPO、Sema3A、TGF-β1可通過調控新生血管生成,并通過促使小梁網細胞凋亡,阻礙房水排出,加重眼壓,加劇視野缺損。因此,原發性開角型青光眼患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1水平與視野缺損加重,視網膜纖維層厚度變薄密切相關,可為POAG預防病情進展及治療提供新方向。

綜上所述,POAG患者房水中EPO、Sema3A、TGF-β1顯著升高,其水平與患者與視網膜纖維層厚度及視野缺損程度密切相關,檢測其水平可幫助患者病情評估,進而為預防POAG病情進展提供重要參考依據,具有較高臨床應用價值。