MITF致病性突變與Waardenburg綜合征臨床表型相關性分析

倪曉琛 李佳楠 楊仕明 陳偉

解放軍總醫院第六醫學中心耳鼻咽喉頭頸外科醫學部(北京 100853)

國家耳鼻咽喉疾病臨床醫學研究中心(北京 100853)

聾病教育部重點實驗室(北京 100853)

聾病防治北京市重點實驗室(北京 100853)

MITF（microphthalmia-associated transcription factor）作為一種基礎螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈結構（basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLH-Zip)家族中的轉錄因子，其主要功能是調控基因的表達水平[1]。不僅可以參與調節神經棘細胞的分化以及發育的過程，同時可以調節黑色素的合成。MITF突變可能導致多種不同的臨床綜合征[2,3]，其中以Waardenburg 綜合征（Waardenburg Syndrome，WS）最為多見。

WS是一種以聽力色素異常為特征的顯性遺傳的綜合征性疾病，呈現高度外顯性，臨床特征具有明顯異質性。其中以虹膜異色、前額白發、感音神經性聾、以及內眥異位為主要臨床表型特征。WS患者可以出現不同程度的感音神經性聾，約占WS患者的90.2%[4]。其中以MITF為致病基因的WS 患者感音神經性聾的發生率為89.6%[4]。WS 還可以表現出不同程度不同部位的色素異常，包括虹膜顏色，頭發，面部以及全身皮膚。

目前WS 臨床表型以及突變位點的相關性的研究局限于PAX3以及SOX10[5]。研究表明無義介導的mRNA 降解途徑（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）對截短蛋白的調控可以部分解釋臨床表型的異質性。MITF突變導致WS 的原因同樣為單倍體劑量不足[6,7]。而目前有關MITF的相關研究尚未有明確報道。MITF是否也受到NMD 機制的調控，從而影響疾病的表型，仍需更多的研究探索。本研究擬采用meta 分析的方法，檢索目前已知的WS的MITF突變位點，并收集突變位點相關臨床表型，通過廣義估計方程（generalized estimating equations,GEE）對突變位點以及表型的相關性進行評估，探尋突變位點的突變規律，突變位點與臨床表型之間的相關性。

1 方法

1.1 建立MITF突變數據庫

1.1.1 文獻納入標準

由兩名具有資質相同的人員進行文獻檢索。查找所有MITF為致病基因的WS 文獻，文獻納入標準：（1）研究中納入的人群為明確診斷為WS 的患者。WS的診斷標準如下：（2）已行基因檢測明確致病基因為MITF突變；（3）具有明確MITF的突變位點。排除標準：（1）合并其他有關遺傳性耳聾的致病基因；（2）報道中MITF并非新發致病性突變。

1.1.2 文獻檢索策略以及篩選過程

文獻檢索范圍從1995年至2021年11月10日，于PubMed，CNKI數據庫進行相關文獻檢索，使用檢索詞”Waardenburg syndrome”；“MITF”,“Waardenburg綜合征”；共檢索到247 篇文章，并由兩名研究人員依據文獻摘要進行初步篩選，將可能符合納入標準的文獻全文下載，閱讀全文并依據納入標準對文獻進行篩選。在初步選定的36篇文獻中，8篇文獻不符合納入標準。1 篇文獻主要內容為MITF突變致病機制的相關研究，其余7篇文獻中，有2篇文獻中患者攜帶除MITF外的其他遺傳性聾相關基因，5篇文獻中報道的致病性突變位點并未新發突變。故最終納入文獻共計28篇[8-35]。文獻檢索流程圖見圖1。

圖1 文獻檢索過程Fig.1 Flow Diagram

1.2 數據收集

收集納入文獻中患者的突變位點信息，納入數據庫中致病性突變位點共計34 例。并同時于ClinicalVariant數據庫進行MITF致病性突變位點檢索，檢索到致病性突變位點共計53 例并納入數據庫。將納入數據庫中所有研究中的突變位點標準化，利用MutationTaster[36]對突變位點編號標準化，參考MITF-205（NM_000248.4）編碼區堿基序列進行編號。突變位點相同時則進行合并?；贓nsembl 平臺[37]（https://www.ensembl.org/index.html）明確突變位點的功能區位置，以及突變基因編碼蛋白質的氨基酸序列、可能影響的蛋白質結構域。收集整理研究中WS患者的臨床表型以及聽力學特征。

1.3 數據整理

突變類型：依據以下突變類型進行分類：錯義突變、無義突變、移碼突變、剪切突變、插入突變、缺失突變。

表型描述：依據研究中描述的臨床表型進行描述以及分類。根據WS 表現出的主要臨床特征，大致分為三類，虹膜顏色改變（Heterochromia irides；Normal），皮膚色素異常改變，頭發顏色改變（Abnormality of the hair；Normal）。其中，進一步將皮膚色素異常分類，分為面部雀斑（Freckles），皮膚脫色素白斑(hypopigmentation)，二者均有（Both），以及二者均無（None），共計四種類型。由于研究中多數患者均為重度感音神經性耳聾，未進一步描述聽力學信息。

1.4 數據分析

若以突變位點進行分組，各組中患者數量較少，易產生偏倚，故不適宜針對突變位點進行分組，故而采用突變基因編碼蛋白質結構以及功能的改變分組，分析不同組間與臨床表型之間的相關性。依據MITF-M 蛋白的功能以及結構特點[38]，將突變蛋白氨基酸改變,分為以下八種，DNA 結合閾的氨基酸替代（AA substitution in the DNA binding region，AA of DNA），HLH 結構閾的AA 替代（AA substitution in the HLH region,AA of HLH），核定位信號的AA 替代（AA substitution in the Nuclear location signal(NLS)region,AA of NLS），缺失DNA結合閾（deletion of DNA binding region,deletion of HLH region,deletion of DNA），缺失HLH 結構閾（deletion of HLH region,deletion of HLH），缺失核定位信號（deletion of the NLS region,deletion of NLS），缺失全部bHLH-Zip 結構閾（deletion of the subtotal region,deletion of subtotal），以及未缺失bHLH-Zip 結構閾（deletion of none of the above region,deletion of none）。家系中不同成員之間攜帶相同的致病基因突變位點，就不同致病位點而言，屬于重復多次測量資料，但是由于家系中各成員之間具有相關性，不具備Logistic 回歸的數據獨立性條件，故采用廣義估計方程（generalized estimating equations,GEE）進行數據分析。以SPSS17.0 軟件進行GEE 數據分析。將不同突變蛋白中的氨基酸改變的類型作為自變量，臨床表型作為因變量進行分析，比較分析不同的氨基酸改變與表型之間的關系。首先進行數據整理，將氨基酸改變這一自變量進行數據處理，生成虛擬變量。導入所有數據后，進行GEE 分析。設定患者編碼作為主變量?；跍仕迫华毩蕜t(quasi-likelihood under the independence model criterion,QIC)選定最佳矩陣模型，在本研究中采用獨立矩陣模型進行分析。由于因變量屬于二分類數據，在回歸分析時采用二元回歸分析（Binary logistic）。選擇不同自變量進行數據分析，研究不同氨基酸改變與表型之間的相關性關系。

2 結果

2.1 文獻篩選結果

在進行文獻檢索以及篩選納入過程后，共計納入文獻28 篇，收集MITF致病性突變位點共計34個。進一步于ClinicalVariant 數據庫再次行MITF致病性突變位點檢索，并經突變位點編號標準化后，最終建立包含58 個致病性突變位點的MITF突變數據庫。并進一步收集到32個家系共計96名患者的臨床表型，包括虹膜顏色、皮膚色素改變、頭發顏色以及聽力下降情況。

在58 例致病性突變位點中，以無義突變最多（21/58，36.2%），其次為錯義突變（13/58，22.4%），移碼突變（13/58，22.4%），剪切位點改變（4/58，6.90%），內含子替代（3/58，5.20%），缺失突變（2/58，3.40%），插入突變（2/58，3.40%）無義突變的突變位點分布較為均勻在各個外顯子中均可見無義突變，而錯義突變多位于7，8 號外顯子（圖2）。以上外顯子均部分參與了MITF特征性結構域bHLH的編碼。在突變位點的改變中則以單堿基改變為主，編碼的蛋白以截短蛋白最為多見。而錯義突變的編碼氨基酸替代均在這一特征性結構域中。這一結構域中包含了DNA 結合域、MITF-M 的核定位信號（Nuclear location signal）以及二聚化的結合位點，乙?；男揎椢稽c。錯義突變導致的氨基酸替代均發生在bHLH結構中。

2.2 突變種類與表型的關系

依據突變基因編碼蛋白的結構以及功能改變，將32個家系分為兩類，共計7組。

聽力下降作為WS 的主要臨床特征，在96 名患者中，有75 名患者呈現出這一臨床特征，約占78%，與既往文獻報道中的89.6%的結果相近。其次為虹膜異色，約占66%。在這其中，以缺失核定位信號組出現比例最高。進一步將GEE 分析結果匯總于表2。就虹膜異色而言，有四種突變類型與虹膜異色的出現具有統計學差異；面部雀斑以及頭發顏色異常均只與一種突變類型的相關性具有統計學差異；聽力下降與氨基酸替換中的兩種類型的相關性具有統計學差異，包括HLH結構閾以及NLS的氨基酸改變。

表1 臨床表型匯總Table 1 Summary of clinical phenotypes

表2 統計結果匯總Table 2 Summary of statistical results

對于不同的突變類型來說，當突變類型為HLH 結構閾的氨基酸替代時，與頭發顏色改變的出現呈現正相關，并具有統計學差異，而與虹膜異色、面部雀斑、聽力下降呈現負相關，并具有統計學意義。

3 討論

本研究通過建立MITF致病性突變數據庫，以GEE的統計學方法進一步探索并分析MITF致病性突變與臨床表型出現之間的關系。

研究結果顯示，突變基因編碼的截短蛋白與聽力下降等均未見相關性。這可能與人體中的截短蛋白監控機制相關，即無義介導的mRNA 降解（nonsense-mediated decay，NMD)。鑒于NMD 在人體轉錄調節中的重要作用以及對mRNA 質量的監控機制[39]，NMD 機制可以清除截短蛋白的mRNA，以減少截短蛋白的編碼，降低截短蛋白的負性效應，并進一步調節遺傳性疾病的相關表型[39]。

本研究中的錯義突變則與臨床表型的出現具有相關性，這一結果可能與MITF的作用過程以及作用特點相關。MITF致病性突變中錯義突變位點大多位于MITF基因的外顯子7，8，均影響MITF蛋白的bHLH-Zip結構閾。bHLH-Zip在MITF發揮作用的過程中具有十分重要的作用，主要參與蛋白質的二聚化，包括同源以及異源二聚化。MITF只有在形成二聚體后才可以與DNA 結合，發揮功能[7]。就MITF-M 而言，其主要在細胞核中發揮調節功能。因而核定位信號（nuclear localization signal，NLS）在MITF-M 的作用過程中具有重要作用。MITF-M 在NLS 介導下，經由核孔小體進入細胞核中，與DNA結合，進而發揮轉錄因子的調節作用[38]。鑒于HLH、NLS 的重要作用，故當錯義突變位點位于以上結構的編碼區時時，盡管未產生氨基酸數目的改變，但是影響了蛋白質的結構，編碼蛋白質出現功能異常，導致疾病相關表型的出現。

本研究還進一步發現，聽力下降與位于NLS以及HLH 的錯義突變具有相關性。這與MITF-M 在聽力形成的重要作用密切相關。目前有關WS 發病機制的研究多認為與神經嵴細胞的異常遷移以及分化相關，尤其黑色素細胞的分化[40]，在黑色素細胞的相關調節通路中，大多通過MITF 將細胞內外的信號進一步轉化，進而調節黑色素細胞的功能[41,42]。因而MITF在WS 致病機制中有著不可替代的作用。其中MITF-M 則是主要表達在黑色素細胞中的一種亞型[43]。MITF-M 不僅是黑色素細胞分化過程中的重要調節因子，還影響黑色素合成過程中的多種基因的表達水平[44,45]，導致相關色素異常表型出現。MITF突變導致聽力下降則與主要與中間細胞有關[46]。黑色素細胞在分化過程中遷移至內耳血管紋中，形成中間細胞，與邊緣細胞以及基底細胞等其他種類細胞，共同組成血管紋，維持耳蝸內電位的穩定。研究表明影響血管紋中這三種主要細胞的突變基因可能通過影響耳蝸內電位，使得耳蝸內電位失衡，進而導致毛細胞凋亡，最終出現聽力損失。尤其中間細胞中的內向回收鉀離子通道Kir4.1 在耳蝸內電位的維持中有著必要的作用[47]。鑒于MITF在聽力形成以及黑色素合成中的重要作用，當發生錯義突變后，MITF的功能以及結構則會受到影響，導致臨床表型的出現。結合以上研究，我們有理由推測HLH 以及NLS 在MITF-M作用過程中的重要作用。但仍需進一步實驗進行驗證。

MITF突變后由于單倍體劑量不足導致WS 相關臨床表型的出現。但MITF在表達過程中受到多種正向以及負向調控，這些調控途徑能否通過調節MITF表達水平而影響疾病表型仍需研究[48]。故而對于同一家系而言，患者出現不同的表型可能與多種調節途徑相關。

本研究也具有一定的局限性。首先MITF數據庫的建立過程中，未將患者的人群以及種族納入考慮范圍。因為不同的人群以及種族之間，相關臨床表型的出現具有一定的差異。如面部雀斑則更易在亞洲人群當中出現。而在本研究納入的人群中，亞洲人群較多，故可能存在一定的偏倚；其次突變類型之間納入的患者數量具有一定的差異，會對結果產生一定的影響。盡管在數據分析時，采用的GEE方程進行分析，對各類型包含的患者數量不具有要求，但是錯義突變的患者數量較少，可能具有一定程度的局限性；最后在進行表型分析時，由于一些明確突變位點的患者未獲取到表型信息，所以未納入進一步的研究中。而在這些人群中，較多突變屬于錯義突變，可能會對數據分析造成一定影響，進而產生偏倚。盡管我們研究中表明特定位置的突變類型與一些臨床表型相關，但是這些表型出現的過程中不僅僅受到MITF的調控，還受到其他多種基因的調控。

本研究中，我們對MITF的突變位點與臨床表型之間的相關性進行了初步分析，得出了表型與突變位點之間的初步分析結果，即致病性突變中錯義突變影響MITF的特征性結構閾bHLH-Zip 編碼區從而影響MITF蛋白的功能，導致疾病的出現。bHLH-Zip 結構閾中包含的DNA 結合域，NLS 等重要結構，在蛋白的作用過程中有著重要意義。尤其NLS 有著重要作用。位于NLS 以及HLH 編碼區的錯義突變，與WS中聽力下降的出現具有相關性。