鹽酸羅格列酮片中雜質A含量的方法學驗證

鄭媛媛,聶 鵬

(貴州省食品藥品檢驗所,貴州 貴陽 550004)

隨著社會經濟水平及人們生活水平的提高,近幾十年來II型糖尿病患病率也在快速增長[1-2]。羅格列酮作為治療II型糖尿病藥物的一種,由葛蘭素史克公司研制,其機制與特異性過氧化物酶體增殖因子激活劑的γ型受體有關,可促進間質干細胞向脂肪細胞分化,促進外周脂肪細胞脂肪生成,降低肝臟和外周甘油三酯,降低內臟脂肪細胞活性,增加脂聯素,可顯著改善胰島素抵抗和代謝綜合征,并具有降低胰島素需求量的功效[3-4]。羅格列酮由于其具有潛在的心力衰竭、液體潴留以及肝損傷[5-6]等副作用被限制使用。在美國藥典(USP)中,收錄的品種為馬來酸羅格列酮片,但是該藥物尚未收錄至《中國藥典》2020年版?，F行的國內標準中,大部分為部頒標準,也有少量為企業自行標準[7-8]。在作者報道的其他文獻中,對鹽酸羅格列酮片進行常規檢測發現,鹽酸羅格列酮片中存在包含雜質A在內的數種雜質,分析并表征了鹽酸羅格列酮片中雜質A的確切結構,其分子結構見圖1。經毒性預測軟件對其潛在毒性進行分析,該雜質其他毒性相對較小,但具有潛在的基因毒性,并且目前尚未有公開資料報道該品種中雜質A的相關含量限制或標準修訂。

圖1 羅格列酮及雜質A的分子結構Fig.1 Molecular formula of rosiglitone and impurity A

由于該藥物具有較好的經濟性和便捷性,為了對現有藥物進行更全面的安全性評價,有必要對該品種的質量標準方法學驗證開展研究,論證其安全使用范圍,以實現現有藥物的最大化利用。本文沿用該品種現行標準中的色譜條件,使用高效液相色譜儀開展鹽酸羅格列酮片中雜質A的含量方法學驗證實驗,研究該雜質的專屬性、穩定性以及線性方程適用范圍,結合加標回收率、重復性以及精密度等實驗,全面論證該雜質的質量分析方法以及檢查項下的含量檢測分析方法,為該品種的質量分析標準提升工作打下堅實的基礎。

1 儀器、試藥和方法

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD檢測器),LC-solution色譜工作站,Mettler AC204 電子天平,Mettler XP26 電子天平,RS-360E超聲波清洗儀(上海瑞勝儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(批號:20025138,美國TEDIA試劑公司)、甲醇(批號:21015240,美國TEDIA試劑公司)、自制超純水、乙酸銨(批號:20171016,成都金山化學試劑有限公司),雜質A對照品(批號:TA0097-BA1218,純度>95%,廣州愛純醫藥科技有限公司),鹽酸羅格列酮片(某廠家生產的3批次市售品)。

1.3 方法

1.3.1高效液相色譜條件

0.025 mol/L乙酸銨溶液-乙腈(50∶50),流速1.0 mL/min,波長245 nm,進樣體積為20 μL,色譜柱Gemini 5u C18,250 mm×4.6 mm,5 μm,柱號598582-4。

1.3.2溶液的制備

供試品溶液:取本品細粉適量(約相當于羅格列酮4 mg),精密稱定,置50 mL容量瓶中,加入少量流動相超聲溶解,放冷后用流動相定容至刻度,搖勻,濾過,取續濾液作為供試品溶液,3批次藥品同法操作。

對照品溶液:精密稱定11.33 mg雜質A,置20 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,并精密量取該溶液1 mL至200 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。

2 結果與分析

2.1 專屬性實驗

精密量取供試品溶液和對照品儲備溶液各1 mL,置 50 mL 量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,與對照品溶液、供試品溶液分別取20 uL注入液相色譜儀,按1.3.1項下色譜條件檢測,在圖2中,專屬性溶液中雜質A峰的保留時間為9.038 min,和其他組分峰分離良好,對照品溶液中雜質A峰的保留時間為9.015 min。以上兩種溶液中雜質峰的保留時間均能與樣品中的未知雜質峰(保留時間為9.035 min)相對應。

圖2 鹽酸羅格列酮雜質A的專屬性液相色譜圖Fig.2 Specific liquid chromatography of impurity A in rosiglitazone hydrochloride

2.2 標準曲線

精密量取對照品儲備液4 mL至50 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻得標準曲線溶液。分別取該溶液5、10、15、20、30、40 uL注入液相色譜儀,進行測定。以峰面積和進樣量計算線性范圍。結果雜質在1.13～9.06 ng范圍內線性關系良好,相關系數r=0.999 9。結果見圖3。

圖3 鹽酸羅格列酮雜質A的標準曲線Fig.3 Standard curve of impurity A in rosiglitazone hydrochloride

2.3 檢出限

精密量取4 mL對照品儲備液至50 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,精密量取該溶液1 mL至5 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,取10 uL注入液相色譜儀,信噪比4.77,結果見圖4,經計算雜質A的檢出限為0.45 ng。

圖4 鹽酸羅格列酮雜質A的檢出限Fig.4 Detection limit of impurity A in rosiglitazone hydrochloride

2.4 定量限

精密量取對照品儲備液4 mL至50 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻。取該溶液5 uL注入液相色譜儀,進行測定。結果見圖5,經計算雜質A的定量限為1.13 ng。

圖5 鹽酸羅格列酮雜質A的定量限Fig.5 Quantification limit of impurity A in rosiglitazone hydrochloride

2.5 重復性實驗

取批號01的鹽酸羅格列酮片按1.3.2項下制備6份供試液,按1.3.1項下的色譜條件測定,結果雜質A含量平均為0.059%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為1.4%,重復性良好。結果見表1。

表1 重復性實驗保留時間及雜質含量Tab.1 Retention time and impurity content of repeatability test

2.6 回收率實驗

分別精密稱取批號01的樣品(平均含量為0.024 4 mg/g):0.050 18、0.050 88、0.051 27、0.050 61、0.051 72、0.050 28 g至50 mL容量瓶加流動相(含雜質A對照 0.000 023 98 mg/mL)40 mL,超聲15 min,取出,放冷,再用流動相稀釋至刻度,搖勻。分別取上述溶液各20 uL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結果見表2,計算結果平均回收率為96.5%, RSD 為3.57%。

表2 回收率實驗結果Tab.2 Experimental results of recovery

2.7 精密度實驗

精密量取對照品儲備液4 mL至50 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,取20 uL注入液相色譜儀。按1.3.1項下色譜條件重復測定6次,峰面積RSD為1.2%,精密度良好,結果見表3。

表3 精密度實驗雜質保留時間及峰面積Tab.3 Impurity retention time and peak area of precision test

表4 穩定性實驗雜質保留時間及峰面積Tab.4 Impurity retention time and peak area of stability test

表5 不同批次的藥品檢測結果Tab.5 Test results from different batches of drugs

2.8 穩定性實驗

精密稱取批號為01的樣品 98.6 mg,按1.3.2項下方法制備供試品溶液,分別在 0、2、4、6、8、10 h取 20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結果峰面積 RSD 為0.5%,表明在 10 h 內,雜質比較穩定。

2.9 樣品測定結果

檢測同一企業生產的3批次樣品,按照相同的處理方法及色譜條件進行檢測,其結果如表6所示,樣品中雜質A的含量均在0.059%附近。結果說明,該藥品質量較為穩定,該方法適用性好。

3 結論

參考《中國藥典》中關于藥品相關雜質研究的指導原則[9],結合化藥雜質研究方法和部分文獻報道[8,10],開展了鹽酸羅格列酮片中相關雜質的方法學驗證研究。在實驗過程中,剛開始使用不同濃度大小的對照溶液進行分析,在HPLC中其對照品的保留時間會存在一定漂移,后將對照品濃度逐級稀釋并檢測,發現低濃度對照品溶液其信號峰的保留時間能夠真實反映出對照品的特征信號,因此選用較低濃度的對照品溶液開展實驗。其專屬性實驗結果表明,該雜質的保留時間為9.0 min,能夠與樣品中的相關雜質信號對應,并且保留時間附近未有其他雜質信號,與主峰之間的分離度明顯,能達到中國藥典相關規定,專屬性強。在作者報道的其他文獻中,通過液質聯用儀和高效液相色譜儀表征了該雜質的確切結構和保留時間,表明樣品中未知雜質的相關信號歸屬為雜質A,在此不再贅述。在檢出限實驗中,該雜質的檢出限與其他化合物的數值較一致,經計算其檢出限為0.45 ng,信噪比為 4.77,該結果顯示雜質A的信號特征較為明顯,其實驗結果與其他研究中的檢出限數值相當,表明本方法能夠較好地通過HPLC分析儀器來檢測該化合物的特征信號和分析其最低有效含量。而在定量限實驗和標準曲線實驗中,由于該雜質含量較低,因此選擇低濃度線性方程范圍開展實驗,其結果顯示該雜質的定量限為 1.13 ng,其線性方程范圍為1.13～9.06 ng,表明能夠在較低含量下對該雜質A進行表征和有效計算。同時,該線性方程相關系數r大于0.999 9,可以在此線性范圍內有效地對該雜質含量進行準確計算。重復性、回收率以及精密度等分項實驗結果表明,該雜質在原標準中的色譜條件下能夠被較好地分析并檢測,在特定色譜條件下能夠有效反映出該化合物的專屬信號,并且能夠較好地重現分析驗證結果,體現了該雜質適用方法的普適性。在穩定性實驗中,該雜質溶液能夠在室溫下10 h內保持穩定,并經檢測得到偏差RSD僅為0.5%的結果,盡管該對照品在固體條件下需-20℃保存,但該結果表明,雜質A的溶液體系體現了一定的穩定性,可在一定時間范圍內通過本方法對該雜質進行分析并能得到有效數據,有力支撐了該方法學驗證實驗的穩定性。最后,通過該色譜條件和檢測方法分析了3批次該品種的雜質A含量,結果均為0.06%,其RSD值偏差較小,符合《中國藥典》收錄的分析方法指導原則中的數值偏差要求,說明該廠家生產的本藥品制劑加工工藝較為固定,該雜質在本藥品制劑混合物體系中也較為穩定。同時也表明該方法能夠有效地檢測并準確分析鹽酸羅格列酮片中雜質A較低濃度的含量,也能準確區分雜質A與其他未知雜質,具有較強的專屬性以及范圍相對較廣的適用性。

綜上,報道了鹽酸羅格列酮片中一種確定結構的雜質A含量的方法學驗證實驗過程及結果。參考該部頒標準的色譜條件,本方法能夠很好地指認雜質A所處的保留時間和相應的紫外光譜吸收信號,并能對其含量進行一定范圍內的準確分析,反映出該方法的普適性和穩定性。本方法簡單、便捷、準確且高效,能夠有力支撐原標準的提升工作,因此,后續擬對該部頒標準進行修訂,增加有關物質項下雜質控制的種類及含量,并可開展該雜質A的遺傳毒性實驗,以充分論證對該雜質限制的論據和限度。