生物標志物EHD3與胃癌中免疫細胞浸潤的相關性研究

王源媛,周 妮,王 達,麥 平

(1.江蘇大學醫學院,江蘇鎮江 212013;2.甘肅省人民醫院消化科,甘肅蘭州 730000)

世界范圍內每年新增胃癌(STAD)患者約99萬人,其中因STAD 去世患者約有73.8 萬人,STAD仍然是臨床上發病率較高的癌癥,常見危險因素有幽門螺旋桿菌(Hp)感染、高齡、高鹽以及長期低果蔬飲食等[1-2]。目前STAD 早期診斷標志物CEA、CA19-9、CA72-4、CA125等敏感性和特異性尚不夠理想,內鏡檢查和活檢仍然是確診的主要手段[3]。STAD 患者的中位生存期為16～28.58個月,行根治性手術的患者的5年生存率僅53.0%[4-5]。盡管目前手術是治療STAD 的唯一方法,但新輔助、輔助治療、靶向治療及免疫治療仍在不斷探索[6]。隨著高通量分子技術的不斷發展,越來越多的免疫治療檢查點被發現,免疫治療方式是STAD 的新興研究方案。因此,探索預后生物標志物,提供一個預測患者生存和個體化治療的標志物尤為重要[7]。EHD3 位于染色體2p23.1上。已有研究表明,EHD3可以調控細胞周期及凋亡,從而抑制膠質瘤的發生發展[8];也有研究報道,EHD3高甲基化可作為結直腸癌的預后標志物[9];同時小細胞肺癌、抑郁癥、急性髓系白血病與EHD3的關系也有報道[10-12]。然而,EHD3在STAD中的預后價值尚不清楚,與免疫細胞浸潤的關系尚未得到研究。

本研究從UCSC XENA[13]下載TCGA 和GTEx基因表達矩陣,對其預后價值進行評價,探討EHD3與其免疫應答的關系,擬為個體化治療帶來新視角。

1 材料與方法

1.1 數據收集和整理

下載UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)經Toil流程[14]統一處理的TCGA 和GTEx的TPM 格式的RNAseq 數據,并從中提取TCGA 的STAD 和GTEx中對應的正常組織數據以及泛癌數據,最后將TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq數據進行log2 轉化,以備后續進行分析比較。

1.2 差異表達基因(DEGs)分析

本研究利用R 軟件(3.6.3版本)中R 包ggplot2(3.3.3版本)進行EHD3差異表達基因分析,同時畫出滿足|log2(FC)|＞1且P.adj＜0.05的DEGs的火山圖。運用R包DESeq2[15](1.26.0版本)分析得出EHD3高低表達組的DEGs,為基因富集分析準備數據。

1.3 功能富集分析

功能富集分析中包含基因本體(GO)數據庫將基因功能分成3類:生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)以及京都基因和基因組百科全書(KEGG)分 析。通 過org.Hs.eg.db 包(3.10.0 版本)用于ID 轉換;Cluster Profiler包[16](3.14.3 版本)用于富集分析,將DEGs 的閾值定義為|log2(FC)|＞1且P.adj＜0.05得到富集結果。

1.4 基因集富集分析

基因集富集分析(GSEA)用一個預先定義的基因集(MSigDB 數據庫)(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中的基因來探索EHD3高低表達組DEGs的功能和表型。對每個分析將計算次數設置為1 000次,滿足FDR(qvalue)＜0.05且P.adj＜0.05的數據集認為有統計學意義[17]。

1.5 免疫浸潤和免疫檢查點分析

本研究共納入24 個免疫細胞[18],采用GSVA包[19](1.34.0 版本)單樣本基因集富集分析(ssGSEA)方法分析免疫細胞浸潤情況。進一步分析了EHD3與免疫檢查點之間的相關性,包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD48[20-22]。

1.6 預測模型開發

采用單因素和多因素Cox 回歸分析,評估EHD3能否作為一個獨立的預后因素,主要的臨床參數包括TNM 分期、年齡以及主要治療結果,同時制作了1年、3年、5年預測OS的列線圖和校準圖。通過觀察校準圖,以對角線作為最佳預測值,判斷模型對實際結果預測效果,同時使用一致性指數(C指數)評估列線圖的準確性。此過程中主要通過rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)完成數據分析[23]。最后通過基因表達譜交互分析(GEPIA2)數據分析平臺[GEPIA 2(cancer-pku.cn)]分析了STAD 患者中EHD3表達的預后價值。

1.7 統計學分析

所有的統計分析和圖表使用R 編程語言(版本3.6.3)進行。分類資料滿足理論頻數＞5且總樣本量＞40的條件,選用卡方檢驗;不滿足理論頻數＞5或總樣本量＞40的條件,選用Fisher精確檢驗。數值變量資料滿足正態分布,選用t檢驗;不滿足正態分布,選用Mann-WhitneyUtest。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 EHD3的差異表達分析

比較 來 自UCSC XENA 數 據 庫 的TCGA 和GTEx中正常組織和腫瘤樣本之間的EHD3表達情況,結果發現,EHD3在STAD 以及大多數類型的癌癥中均有明顯上調(圖1)。此外,在EHD3的高低表達組中共鑒定出2 797 個DEGs,篩選條件設置為|log2(FC)|＞1且P.adj＜0.05,其中高表達基因數目2 227個,低表達基因數目570個。

圖1 EHD3在不同組織樣本中的表達Fig.1 Expression of EHD3 in different tissue samples

2.2 EHD3功能富集分析

GO 功能分析和KEGG 富集分析的結果如下。在滿足P.adj＜0.05且FDR(qvalue)＜0.05條件下,BP共有749條,CC共有119條,MF共有81條,KEGG 共有46條。其中BP包括化學突觸傳遞的調節、跨突觸信號的調節、肌肉系統過程、膜電位的調節和軸突發生等(圖2A);CC 包括含膠原蛋白的細胞外基質、突觸膜、神經元胞體、突觸前和谷氨酸能突觸等(圖2B);MF 包括受體配體活性、通道活動、被動跨膜轉運蛋白活性、金屬離子跨膜轉運活性和底物特異性通道活性等(圖2C)。KEGG 包括神經活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路、焦點粘連和c AMP信號通路等(圖2D)。

圖2 功能富集分析結果Fig.2 Functional enrichment analysis

2.3 EHD3基因集富集分析

利用預先確定的基因集(MSigDB 數據庫)做GSEA 分析,以進一步確定STAD 中EHD3高表達和低表達所參與的生物學功能。當符合FDR(qvalue)＜0.05且P.adj＜0.05時,發現EHD3高表達DEGs顯著富集于GO 功能中的免疫應答調節信號通路、淋巴細胞活化的調控、T 細胞活化、體液免疫應答以及吞噬作用等(圖3A);低表達組EHD3顯著富集于核糖體、線粒體基因表達、呼吸小體、氧化還原酶復合物和病毒基因表達等(圖3B)。B、T 細胞受體信號通路、癌癥途徑以及WNT、MAPK 信號通路等KEGG通路均顯著富集于EHD3高表達DEGs(圖3C);核糖體、氧化磷?；?、DNA 復制、RNA 降解和嘧啶代謝等KEGG 通路在低表達EHD3的DEGs中顯著富集(圖3D)。在標志性基因集中上皮間質轉換、炎癥反應、細胞凋亡、KRAS信號傳導和TGF-β信號傳導顯著富集于EHD3高表達組中(圖3E);MYC、E2F 靶標、氧化磷?；?、G2M 檢查點以及DNA 修復顯著富集于EHD3 低表達組中(圖3F)。上述結果表明,EHD3可能對STAD 患者腫瘤微環境及免疫應答產生影響。

圖3 EHD3相關的GSEA富集分析結果Fig.3 EHD3-related GSEA enrichment analysis

2.4 EHD3免疫浸潤和免疫檢查點分析

通過觀察24個免疫細胞中不同EHD3 表達組之間的相互關系,發現T 細胞、B 細胞、CD8T 細胞、樹突細胞(DC)、嗜酸性粒細胞、iDC、巨噬細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、NK(自然殺傷)細胞、p DC、Tcm、Tem、TFH、Tgd、Th1(P均＜0.001)以 及TReg細胞(P=0.003)在EHD3中高表達;Th17細胞(P=0.014)、Th2(P=0.006)細胞在EHD3中低表達(圖4A)。此外,本研究評估了24種免疫細胞與EHD3的相關性,結果表明,EHD3 與Th17 細胞(r=-0.113,P=0.029)、Th2 細 胞(r=-0.116,P=0.025)呈負相關;aDC、NK CD56bright 細胞、NK CD56dim 細胞和T helper細胞與EHD3無相關性,其余免疫細胞與EHD3 呈正相關(P＜0.001,圖4B、圖4C)。最后分析了EHD3的表達量與免疫檢查點(包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD48)之間的關聯,發現高表達EHD3 組PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD48 的表達水平均高于低EHD3表達組,同時發現8個免疫檢查點均與EHD3的表達呈正相關(圖5)。

圖4 EHD3表達與免疫細胞浸潤之間的關系Fig.4 Association between EHD3 expression and immune cell infiltration

圖5 EHD3表達與免疫檢查點之間的關系Fig.5 Association between EHD3 expression and immune checkpoints

2.5 EHD3的表達與臨床特征的關系

分析STAD 中EHD3高低表達組之間的主要臨床特征,發現P值均大于0.05,說明分組之間相對均衡,能更好地用于后續研究(表1)。通過Cox回歸分析了潛在的預測因子,單因素分析顯示TNM 分期、主要治療結果、年齡及EHD3的表達水平具有統計學意義(P＜0.05),然后再進一步進行多因素分析和森林圖繪制,其結果說明EHD3為一獨立預后因素(HR=2.112,95%CI:1.340～3.327,P=0.001,圖6)。

表1 STAD中EHD3表達與TNM 分期、主要治療結果、年齡及HP感染的關系Tab.1 Association of EHD3 expression in STAD with TNM stage,primary treatment outcome,age and HP infection[n(%)]

圖6 TNM 分期、主要治療結果、年齡及EHD3 的多因素Cox回歸分析結果的森林圖Fig.6 Forest plot shows the results of the multifactorial Cox regression analysis for TNM stage,primary treatment outcome,age and EHD3

2.6 預測模型的構建

將EHD3及臨床特征納入列線圖模型(圖7A),開發預測1年、3年、5年的生存概率,同時繪制校準圖(圖7B)。結果發現C 指數為0.737(95%CI:0.713～0.761),校準圖的預測概率與觀測結果基本一致,說明模型有較好的預測性。此外,在GEPIA2數據庫中進行了Kaplan-Meier生存分析,結果顯示,EHD3高表達的STAD 患者與不良結局有關(P=0.002,圖7C)。

圖7 STAD中EHD3基因的預后預測模型和生存曲線Fig.7 Prognostic prediction model and survival curve of EHD3 gene in STAD

3 討 論

STAD 是常見的惡性腫瘤,目前以手術切除為主,但其總體生存率仍較低,免疫治療等新療法已成為STAD 新的治療希望[24-25]。免疫治療與其他治療協同作用的方案層出不窮,給STAD 患者帶來了新的治療前景,在不遠的未來,較好的生物標志物一定能使STAD 治療更加個性化和精確化[26-27]。

本研究結果表明,EHD3在STAD 患者中表達與其預后及免疫細胞浸潤有明顯關系。本研究首先發現EHD3在STAD 中表達上調,通過對比不同腫瘤表達情況,發現EHD3的表達在大多數類型的腫瘤中顯著上調。隨后通過富集分析EHD3的基因功能,提示EHD3與免疫應答有關。隨著對腫瘤微環境和細胞免疫調節等方面研究的不斷深入,更多的研究證實免疫細胞在腫瘤的發生和發展過程中具有重要而又復雜的功能[28-30]。

從富集分析的結果看,EHD3表達量與多數免疫細胞呈顯著正相關。在免疫細胞中,自然殺傷(NK)細胞與EHD3表達的相關度最高(r=0.525,P＜0.001)。NK 細胞作為一種細胞毒性淋巴細胞,其表面受體的活化或抑制作用可調控腫瘤活性并可增強免疫治療抗腫瘤作用,而減少治療毒性反應[31-32]。TFH 細胞(r=0.512,P＜0.001)和EHD3 的表達呈正相關,TFH 細胞在對生發中心形成過程中具有重要意義。生發中心一旦形成則需要TFH 細胞維持其存在,調控生發中心B 細胞向漿細胞及記憶B 細胞的分化,進而提高CD8 T 細胞效應器功能以促進抗腫瘤免疫[33-34]。有文獻報道,THF細胞在乳腺癌患者的長期存活過程中存在正相關[35]。另外,本研究還揭示了EHD3的表達與其免疫檢查點(包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、VISTA、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD48)之間存在正相關關系。提示EHD3在腫瘤免疫學研究中具有重要意義,可作為免疫治療靶點而非單純作為預后標志物使用。

接著就EHD3對STAD 患者的預后影響進行分析。Cox回歸分析結果顯示,除常見的危險因素如年齡、主要治療結果等之外,EHD3作為STAD 患者獨立預后指標存在,并進一步構建了基于EHD3表達水平的列線圖預測模型,對STAD 的1年、3年和5年生存率進行預測,其C 指數達到了0.737(95%CI:0.713～0.761),而校準圖預測概率則與觀測結果吻合良好,表明該模型具有良好預測性。通過Kaplan-Meier生存分析驗證了EHD3表達與OS相關,EHD3高表達與STAD 的不良結局有關。本研究所建立的模型能夠為STAD 患者預后預測及個性化評估提供新的切入點。但本研究尚存在一定的局限性,應在建立前瞻性研究預測模型的同時加入驗證集的臨床樣本,且EHD3的相關調控機制及信號通路還需要深入研究。

綜上所述,EHD3在STAD 中表達上調,且高表達與預后不良有關。這可能與免疫細胞浸潤有關。本研究提出了一個新觀點,即EHD3是一個新的預后因素,也可能是STAD 的潛在治療靶點。未來的研究將重點關注STAD 中EHD3的具體機制。