西洛他唑改善2型糖尿病小鼠腸黏膜屏障損傷的機制

宋平義,蔣世秋,胡 娟,檀佳璐,楊 嵐,王 強

(西安交通大學第一附屬醫院麻醉手術部&腦科學中心,陜西西安 710061)

腸黏膜屏障是將體內、體外環境分開,并參與維護機體內環境穩態的重要防御屏障。腸黏膜屏障的完整性具有保護機體免受腸道有害微生物及其代謝物影響的作用[1]。2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者腸黏膜屏障功能受損可導致微生物產物全身性內流,從而增加腸道感染風險和全身炎癥風險[2-3]。因此,維持腸黏膜屏障正常功能對于T2DM患者有至關重要的意義。

T2DM 患者血清中血小板P2Y12受體表達顯著增加并呈持續性激活狀態,表現為血小板黏附、聚集和促凝作用的增強,且有研究表明,慢性高血糖和餐后高血糖狀態與血小板活化增強相關[4-6]。同時,抑制血小板活化可以改善膿毒癥腸屏障功能損傷,表明活化的血小板可能與膿毒癥時腸黏膜屏障功能受損有關[7]。西洛他唑是一種新型血小板聚集抑制藥,通過抑制炎癥改善T2DM 患者的代謝異常和全身胰島素抵抗,廣泛應用于預防和治療多種糖尿病慢性并發癥[8-9]。研究表明,在非酒精性脂肪性肝病中,血小板依賴于P2Y12受體釋放的CD40 配體(CD40L)與CD40作用從而激活CD8+T 細胞發揮抗腫瘤免疫的作用[10]。血小板CD40L 還可通過誘導膠質細胞活化破壞高血壓大鼠模型的血腦屏障,從而介導腦的炎癥損傷[11]。然而,西洛他唑是否可以通過抑制血小板活化改善糖尿病腸黏膜屏障損傷尚不清楚。本實驗選用db/db糖尿病小鼠和對照m/m 小鼠,采用西洛他唑干預的方式,通過檢測腸黏膜屏障功能以探究西洛他唑對T2DM 腸屏障損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體級別的8周齡雄性db/db小鼠和相同條件的對照m/m 小鼠,購買自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,飼養于西安交通大學第一附屬醫院腦科學研究中心SPF動物房,室溫21～25℃,相對濕度50%～60%,12 h/12 h晝夜交替光照。db/db小鼠為每2～3只一籠,對照m/m 小鼠為每4只小鼠一籠進行飼養,可自由進食與飲水。所有動物實驗均按照西安交通大學動物研究所制定的標準進行。

1.2 生物信息學分析

通過GEOquery 包從GEO 數據庫中下載GSE142153數據集,獲取糖尿病及對照組患者基因集。通過limma包Normalize Between Arrays函數再次標準化數據,利用limma包進行差異分析(倍數變化＞2或＜0.5,P＜0.05)。差異分析結果用火山圖進行可視化,差異基因用clusterProfiler包進行富集分析。

1.3 材料與試劑

西洛他唑(cilostazol,cilo)購買自美國MedChemExpress公司;sCD40L ELISA 試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司;4 ku異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-葡聚糖(dextran)購買自美國Sigma公司;兔抗CD40購買自美國Abcam公司;兔 抗ZO-1 購 買 自 美 國Affinity 公 司,兔 抗Occludin購買自中國ABclonal公司,兔抗β-Tubulin 購買自中國ABclonal公司。

1.4 動物分組及干預

將db/db小鼠和對照m/m 小鼠隨機分為m/m+溶劑組、m/m+西洛他唑組、db/db+溶劑組、db/db+西洛他唑組,每組10只小鼠。其中m/m+西洛他唑組及db/db+西洛他唑組小鼠給予西洛他唑處理,西洛他唑溶解于5 g/L羧甲基纖維素鈉鹽(carboxymethyl cellulose sodium salt,cmc),m/m+溶劑組和db/db+溶劑組給予等量5 g/L羧甲基纖維素鈉鹽溶劑處理,采取灌胃給藥的方式,并根據體質量大小以30 mg/(kg·d)的藥物劑量及等量溶劑給藥4周。

1.5 ELISA檢測CD40L水平

各組小鼠禁食12 h后,通過異氟烷麻醉小鼠并眼眶取血,室溫靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min收集小鼠血清,并嚴格按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作,檢測血清可溶性CD40L(sCD40L)水平。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

小鼠經過異氟烷麻醉后,取小鼠小腸組織立即制備蛋白樣品或置于-80℃冰箱待用。在小腸組織中加入適量快速裂解液,并于冰上充分研磨及超聲破碎,將勻漿液以12 000 r/min轉速于4℃離心10 min,提取上清液并采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。加入適量5×蛋白上樣緩沖液,于100℃高溫處理使蛋白變性。蛋白樣品經電泳分離后,以恒流轉膜,封閉采用50 m L/L脫脂牛奶于常溫下孵育1～2 h,之后置于適量的一抗溶液中(兔抗CD40、兔抗ZO-1、兔抗Occludin、兔 抗β-Tubulin),4℃孵 育 過 夜 后,進 行10 min×3次洗膜處理。二抗于室溫孵育1～2 h后,再次進行洗膜處理。利用ECL發光液于化學發光儀進行曝光顯像,拍攝后的圖像使用Image J分析。

1.7 腸道通透性檢測

小鼠過夜禁食后,用4 ku異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-dextran)溶液對小鼠進行灌胃處理。經過1.5 h后,小鼠眼眶取血,于激發波長為485 nm、發射波長為535 nm 條件下,檢測熒光吸光度值。

1.8 腸道含水量測定

測定小鼠腸道組織含水量以評估小鼠腸道水腫的程度。取小鼠新鮮小腸組織,立即稱重,此時記為組織濕重。隨后將組織置于60℃烘干48 h后再次稱重,此時為組織干重,計算含水量(%)=(組織濕重-組織干重)/組織濕重×100%。

1.9 腸道細菌計數

取小鼠腸系膜淋巴結組織、肺臟組織并分別將其勻漿處理,室溫離心提取上清液。經過連續稀釋后,將500μL稀釋液均勻平鋪在TSA 瓊脂平板上,于37℃恒溫孵育24 h后進行細菌含量計數。

1.10 統計學分析

統計分析使用Graphpad Prizm 軟件完成。連續變量選用單因素方差分析(Turkey事后檢驗),計量資料采用均數±標準差表示。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 糖尿病患者差異基因富集通路分析

通過提取GSE142153數據集中10例對照組和23例糖尿病患者外周血單核細胞基因進行分析,結果發現糖尿病患者共有109個基因上調,73個基因下調(圖1)。差異基因富集在血小板活化、內皮細胞屏障功能等通路中,提示糖尿病患者存在血小板活化及內皮屏障損傷。

圖1 糖尿病患者差異基因富集通路Fig.1 Differentially expressed genes enriched pathway of diabetic patients

2.2 西洛他唑抑制糖尿病小鼠體內血小板的活化

ELISA 結果顯示,db/db小鼠血清中sCD40L表達量較對照m/m 小鼠明顯升高(P＜0.05),而給予西洛他唑處理后,db/db小鼠血清中sCD40L 表達水平下降(P＜0.05,圖2A)。除此之外,Western blotting結果顯示,與m/m 溶劑組小鼠相比,db/db溶劑組小鼠腸道組織中CD40蛋白水平升高(P＜0.05),db/db西洛他唑組小鼠腸道組織中CD40蛋白水平下降(P＜0.05,圖2B、圖2C)。

圖2 西洛他唑對血清sCD40L水平及腸道CD40蛋白表達的影響Fig.2 The effect of cilostazol on serum sCD40L and intestinal CD40 expression

2.3 西洛他唑改善小鼠腸道通透性、含水量及腸道菌群含量

通過給各組小鼠給予4 ku FITC-dextran 溶液灌胃處理以檢測小鼠的腸道通透性,結果顯示,db/db溶劑組小鼠血清FITC 的濃度顯著高于m/m 溶劑組小鼠(P＜0.05);西洛他唑干預后,db/db西洛他唑組小鼠血清FITC 的濃度明顯降低(P＜0.05,圖3A)。與m/m 溶劑組相比,db/db溶劑組的腸道含水量明顯升高,腸組織明顯水腫(P＜0.05);db/db西洛他唑組腸道含水量明顯降低,腸組織水腫程度減輕(P＜0.05,圖3B)。通過小鼠腸道細菌平板計數,結果發現與m/m 溶劑組和m/m 西洛他唑組相比,db/db溶劑組腸系膜淋巴結及肺臟組織勻漿菌落數均明顯升高,西洛他唑的干預顯著降低了兩個部位的菌落數(P＜0.05,圖3C、圖3D)。

圖3 腸道通透性、含水量及組織菌落計數的比較Fig.3 The effect of cilostazol on the permeability of intestine

2.4 小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達水平

Western blotting結果顯示,糖尿病db/db溶劑組小鼠腸道組織中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達水平明顯低于對照m/m 溶劑組小鼠(P＜0.05);與db/db溶劑組小鼠相比,db/db西洛他唑組小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達水平升高,差異具有統計學意義(P＜0.05,圖4)。

3 討 論

腸道屏障是機體隔絕內環境與腸道毒素的關鍵結構。T2DM 患者往往伴隨腸道屏障損傷,一旦出現外界刺激,將大大增加其炎癥感染和罹患膿毒癥風險。遺憾的是,T2DM 腸道屏障損傷機制仍未闡明。研究表明,抑制血小板活化可以改善小鼠腸黏膜屏障損害[7],而糖尿病導致的慢性高血糖在內的代謝異?？赡軐е麦w內血小板活化,嚴格控制代謝功能等方法可減少體內血小板的活化[12]。本研究通過對糖尿病與非糖尿病患者的外周血單核細胞轉錄組數據進行分析發現,其差異基因在血小板活化和上皮屏障相關通路富集,進而證實抗血小板藥物西洛他唑可抑制血小板活化,下調CD40-CD40L 信號通路、改善腸道通透性和含水量,提高腸道緊密連接蛋白表達,為改善糖尿病腸道屏障功能提供了新策略和新靶點。

本研究借助GSE142153數據集中10例對照組和23例糖尿病患者外周血單核細胞基因進行分析,發現差異基因富集在血小板活化、內皮細胞屏障功能等通路中,在一定程度上可以反映糖尿病患者體內基因的表達變化趨勢。由于人與小鼠基因具有高度同源性,我們推測模式動物體內具有相似變化。然而,使用外周血基因變化推測腸道變化存在組織間差異,因此,本研究通過后續血液及腸道組織相關實驗予以證明,完善了相應證據。當然,基于本研究結果,針對二代測序組織特異性不足這一缺陷,我們將在后期展開針對腸道的組學分析,進一步探索糖尿病腸道屏障功能損傷的下游分子機制。

血小板是屏障功能的重要調控者,在維持血腦屏障、血氣屏障和血腸屏障等功能中具有關鍵作用[13]。同時,血小板因其包含數百種可分泌蛋白,在靜息和活化狀態對屏障功能的調控展現出雙向作用,即靜息態血小板往往維持屏障功能穩定,而活化態血小板卻表現出損傷屏障功能的傾向[14]。糖尿病及相關并發癥患者體內sCD40L 水平異常升高,并且T2DM 與sCD40L 水平升高在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中呈現獨立相關[15-16]?；罨难“迨莝CD40L的主要來源,而CD40-CD40L 信號通路參與糖尿病在內的多種炎癥性疾病的病理生理過程[17]。研究表明,西洛他唑可降低T2DM 患者體內的C 反應蛋白和sCD40L的水平,從而延緩其動脈粥樣硬化和慢性炎癥的進展[18]。我們的研究結果顯示,糖尿病小鼠血清中sCD40L明顯升高,腸道組織CD40的表達量顯著增加,而西洛他唑干預可明顯改善血清sCD40L和腸道組織CD40的表達水平。

既往研究發現,西洛他唑可以通過抑制血小板與其他免疫細胞的相互作用來改善小鼠腸道炎癥及損傷[19-20]。為進一步證實西洛他唑是否可改善T2DM小鼠腸道屏障功能,本研究針對T2DM 小鼠腸道屏障功能研究發現,糖尿病小鼠腸道黏膜屏障明顯受到破壞,表現為腸道通透性、含水量、組織勻漿菌落數明顯增加,腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達水平下降,而西洛他唑治療明顯緩解了糖尿病小鼠腸道黏膜屏障的損傷,提示其對改善糖尿病小鼠屏障功能的有效性。當然,該實驗結果僅僅為西洛他唑改善T2DM 屏障功能提供了實驗室證據和理論依據,其具體作用仍待臨床多中心大樣本研究證實。

綜上,本研究表明西洛他唑可能通過抑制血小板活化,減少血清及腸道組織中sCD40L 和CD40的表達,進而改善糖尿病小鼠腸道黏膜屏障的破壞。本研究為西洛他唑對T2DM 及其相關并發癥的影響及其潛在作用機制提供了科學依據。