間作菠蘿模式下不同品種椰子根際土壤微生物多樣性及群落結構特征

劉瑩瑩,盧麗蘭,謝淑云,陳思婷,王玉萍,楊偉波

[1 中國地質大學(武漢)地球科學學院,武漢,430074;2 中國熱帶農業科學院椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室,海南文昌,571339]

椰子為海南省重要的經濟作物,樹形較高,土地利用率低,容易滋生雜草,雜草既會增加椰園管理成本,又影響椰樹生長和經濟效益,椰子短期經濟效益不佳,嚴重制約椰子產業發展[1-2]。椰子長時間定植同一位置,土壤地力易發生退化,歸因于根系分泌物以及根系微生物變化。根系分泌的化感物質會累積在土壤,影響根系生長,降低椰子吸收營養的效率,最終導致椰子長勢下降,抗性降低。間作可增強根系效應,改善微生物群落結構,改良土壤環境,增加作物產量[3-6]。椰子幼樹與豆科牧草間種發現,椰子生長速度較單作提高20%～30%[7];與單作椰子相比,椰子間作牧草提升土壤養分有效成分含量[8];椰子常間作短期作物來增加種植收入[9-11]。不同椰子品種根系生長和發育具有不同特性,根際分泌物、根際營養、與間作作物相作也可能存在差異。目前,間作菠蘿對不同品種椰子種植根際區域土壤養分及微生物的影響鮮見報道,因此開展此項研究可為椰子間作栽培模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

在海南省文昌市中國熱帶農業科學院椰子研究所的1隊椰子種植基地開展試驗,北緯19°45′,東經109°21′,地勢平坦,屬于熱帶季風島嶼氣候,年平均溫度23.9 ℃,年平均日照時數1 953.8 h,常年降雨量1 721.6 mm,砂質或磚紅壤黏粉砂質土壤,種植有椰子、菠蘿、番木瓜等熱帶經濟作物。

1.2 試驗設計

設置紅矮椰子文椰3號單作(對照)、紅矮椰子文椰3號間作菠蘿、香水椰子文椰4號間作菠蘿、黃矮椰子文椰2號間作菠蘿1、黃矮椰子文椰2號間作菠蘿2 等5個處理,椰子株行距6 m×6 m,兩行椰子間種植菠蘿兩行,株行距50 cm×50 cm;文椰2號間作2處理分布一個片區,其他處理分布在另一個片區,兩個片區直線距離1 km,所有處理管理方式一致。椰子定植3年,間作菠蘿連續3年,每年菠蘿定植5個月時采集土壤樣品。

土樣采集:每處理隨機挑選區域3個,每個區域面積約40 m2,每個區域選擇椰子3株,將根系挑出,抖根收集根際土壤進行混樣,土樣帶回實驗室,連續3年采集根際土壤樣品風干保存備用;第3年取部分新鮮土樣用于提取微生物總DNA進行高通量測序。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質測定 風干及過篩后的土樣進行理化性質分析:土壤pH值(土壤∶水=2.5∶1)采用便攜式土壤pH值計,電導率采用便攜電導率儀,有機質采用重鉻酸鉀容量-外加熱法,全氮采用半微量凱氏法,堿解氮采用堿解擴散法,全磷采用HClO4-H2SO4法,速效磷采用鉬銻抗比色法,全鉀采用NaOH熔融-火焰光度法,速效鉀采用NH4Ac浸提-火焰光度法[12],有效鈣、鎂含量采用DTPA提取-原子吸收分光光度法(AAS,型號SHIMADZU AA6300F)測定。

1.3.2 土壤微生物基因組DNA的提取、PCR擴增和測序 土壤微生物總DNA采用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司產)提取,提取的DNA樣品送至百邁客生物技術有限公司進行測序。整個上機流程包括PCR的擴增,PCR產物混樣,純化,文庫構建。

采用兩輪法對細菌16S rDNA V3—V4區進行擴增,上游引物338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;下游引物806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′;真菌ITS1擴增,上游引物序列ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;下游引物序列ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

反應體系10 μL,基因組DNA 5～50 ng,*Vn F(10 μM)0.3 μL,*Vn R(10 μM)0.3 μL,KOD FX Neo Buffer 5 μL,dNTP(2mM each)2 μL,KOD FX Ne 0 0.2 μL。

擴增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,擴增25個循環,72 ℃延伸7 min。然后以第一次的PCR產物為模板,采用Illumina橋式PCR兼容引物,反應體系20 μL,PCR純化引物5 μL,*MPPI-a(2 μM)2.5 μL,*MPPI-b(2 μM)2.5 μL,2×Q5HF MM 10 μL。擴增條件:98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,擴增10個循環,72 ℃延伸5 min。PCR產物經磁珠法回收并定量。每處理樣品的重復個體PCR產物進行等量混合,保證樣品檢測濃度,將15份混合樣品送至百邁客生物技術有限公司,利用Illumina-MiSeq平臺進行高通量測序。

1.3.3 數據分析 對97%相似度的OTU代表序列進行分類學分析(USEARCH,version 10.0),在界、門、綱、目、科、屬水平上統計各個樣品的細菌和真菌群落組成,繪制物種分類條形圖以及物種豐度熱圖。采用16S和18S序列,重取樣統一測序深度后,計算alpha的多樣性指數,即Chao1、Shannon、Simpson指數和覆蓋度。繪基于OTUs豐富度,繪制稀釋曲線圖,進行稀釋分析。

Beta多樣性分析:基于binary jaccard呈現物種的多樣性矩陣。根據R語言繪出樣本的主成分分析(PCA、NMDS)、環境因子以及樣本組成的相關性分析(CCA)。通過Mothur軟件完成OTU劃分、alpha多樣性指數計算以及稀釋分析;利用Graphpad 6軟件完成配對t檢驗及作圖;采用R的vegan軟件包分析PCoA和CCA。以OUT數據標準化(取對數)之后,選取數目最多的物種,基于R heatmap作圖,熱圖每1個色塊表示1個樣品的1個屬豐度,樣品橫向排列,物種縱向排列,聚類分析樣品間相似性和各分類群落組成的相似性。

2 結果與分析

2.1 椰子根際土壤理化性質

從表1可以看出,與單作處理相比,間作處理顯著增加土壤含水量、電導率,有機質、全氮、堿解氮、全鉀、速效鉀、全磷、速效磷、有效鈣和有效鎂含量,說明間作處理可以增加椰子根際土壤的養分含量。其中,文椰2號間作1處理土壤養分含量最高,其次是文椰2號間作2,主要可能由于椰子與菠蘿根際分泌物的交叉影響。5種處理的pH值變化不大,間作處理比單作處理有所降低。間作處理中,菠蘿種植和椰子互作影響土壤養分吸收和轉換等作用,可能是引起土壤養分含量差異的原因。

表1 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤理化性質比較

2.2 椰子根際土壤微生物多樣性及群落結構

2.2.1 土樣測序情況 從圖1和表2可以看出,15個樣品稀釋曲線最終平緩,測序已接近飽和,說明取樣基本合理,可以正確反映15個土樣中微生物群落,再結合各樣品的覆蓋率為0.969 1～0.998 5,測序基本包括土樣全部微生物類群,可以看出微生物的群落結構組成。比較真菌和細菌稀釋曲線發現,真菌稀釋曲線更加平緩,并且覆蓋率也更高,說明幾乎全部的真菌物種被發現,而仍有少量細菌種類未被發現。

圖1 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土樣稀釋曲線

表2 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤測序及alpha多樣性

2.2.2 根際土壤微生物群落多樣性 從表2可以看出,不同間作處理椰子根際土壤細菌的Chao1和Ace具有相同變化趨勢,即從高到低依次為文椰4號間作>文椰2號間作2>文椰2號間作1>文椰3號單作>文椰3號間作。其中,文椰4號間作的土壤細菌豐度最大,文椰3號間作的土壤細菌豐度最小;文椰4號間作、文椰2號間作2和文椰2號間作1處理的Ace比文椰3號單作處理分別高30.06%、27.09%和15.28%,而文椰3號間作處理的Ace比文椰3號單作處理低18.78%,文椰4號間作、文椰2號間作2和文椰2號間作1處理的Chao1比文椰3號單作處理分別高24.85%、21.27%和9.20%,而文椰3號間作處理的Chao1比文椰3號單作處理低21.36%。文椰3號單作處理細菌的Shannon指數最小,Simpson指數最大,細菌多樣性最低;而文椰4號間作處理細菌的Shannon指數最大,Simpson指數最小,土壤細菌的多樣性最高;文椰4號間作、文椰2號間作2、文椰2號間作1和文椰3號間作的細菌Simpson指數比文椰3號單作處理低82.13%、65.46%、71.02%和53.33%,文椰4號間作、文椰2號間作2、文椰2號間作1和文椰3號間作的細菌Shannon指數比文椰3號單作處理高20.37%、17.64%、13.65%和5.81%。間作處理的細菌豐度除文椰3號間作外均大于單作處理,而間作處理的細菌多樣性均大于單作處理,說明間作可以明顯提高細菌豐度和多樣性。

不同品種不同間作處理的根際土壤真菌的Chao1和Ace具有相同的變化趨勢,即從高到低依次為文椰2號間作2>文椰3號單作>文椰2號間作1>文椰4號間作>文椰3號間作。其中,文椰2號間作2的土壤真菌豐度最大,文椰3號間作的土壤真菌豐度最小;除文椰2號間作2處理外,間作處理的真菌豐度均低于文椰3號單作處理,文椰2號間作2處理的Ace和Chao1比文椰3號單作處理高30.00%和30.72%,文椰2號間作1、文椰4號間作和文椰3號間作處理的Ace比文椰3號單作處理低7.31%、9.45%和20.25%,文椰2號間作1、文椰4號間作和文椰3號間作處理的Chao1比文椰3號單作處理低6.16%、9.17%和22.04%。 文椰2號間作2處理的真菌Shannon比文椰3號單作處理高22.55%,文椰2號間作1、文椰4號間作和文椰3號間作處理的真菌Shannon比文椰3號單作處理低1.83%、12.04%和10.03%;文椰4號間作處理的真菌Simpson比文椰3號單作處理低3.56%,文椰2號間作2、文椰2號間作1和文椰3號間作處理的真菌Simpson比文椰3號單作處理高8.42%、3.12%和1.99%。

15個土樣中細菌OTU約是真菌的2.8～6.1倍,顯著高于真菌,說明不同品種椰子間作菠蘿其根際土壤微生物以細菌為主。其中,細菌OTU由大到小依次為文椰4號間作>文椰2號間作2>文椰2號間作1>文椰3號單作>文椰3號間作,真菌OTU由大到小依次為文椰2號間作2>文椰3號單作>文椰2號間作1>文椰4號間作>文椰3號間作。這表明文椰4號間作處理細菌類群最豐富,文椰2號間作2處理真菌類群最豐富,而文椰3號間作處理細菌和真菌的OTU均最低,微生物類群最貧乏。說明間作在一定程度上可以增加細菌數量以及降低真菌數量。

從圖2可以看出,文椰3號單作、文椰2號間作2、文椰2號間作1、文椰3號間作和文椰4號間作獨有的細菌OTU分別為71、48、19、58和32,共有的細菌OTU為352,5種處理之間相互重疊,共有細菌OTU占比大,5個處理的根際土壤細菌類群一致性較高。文椰3號單作、文椰2號間作2、文椰2號間作1、文椰3號間作和文椰4號間作獨有的真菌OTU分別為108、70、57、41和47,共有的真菌OTU為51,5個處理的根際土壤真菌類群一致性較低。

圖2 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤細菌和真菌的OTU分布

2.2.3 根際土壤微生物群落組成 從圖3和圖4可以看出,15個樣品高通量測序后,除未分類和其他門細菌外,數量排名前10的細菌占比64%以上。5個處理中細菌相對含量有差異,但數量排名前10的細菌門相同,包括變形菌門,相對含量26.02%～34.08%;酸桿菌門,相對含量10.02%～20.45%;擬桿菌門,相對含量4.45%～14.02%;疣微菌門,相對含量5.25%～8.25%;放線菌門,相對含量1.75%～6.58%;浮霉菌門,相對含量2.54%～6.25%;厚壁菌門,相對含量4.12%～5.24%;芽單胞菌門,相對含量0.89%～6.25%;Myxococota,相對含量2.01%～4.05%;硝化螺旋菌門,相對含量1.25%～4.02%。文椰3號單作的根際土壤擬桿菌門(4.45%)、芽單胞菌門(0.89%)相對數量顯著低于其他處理(p<0.05),5個處理其他細菌門相對數量無顯著性差異(p>0.05),5個處理的變形菌占比均最大?；陂T水平的細菌聚類熱圖分析表明,文椰2號間作1、文椰2號間作2、文椰4號間作與文椰3號間作的細菌群落聚為一類,處于同一水平。文椰3號單作的細菌群落組成與其他處理相差較大,單獨聚為一類。

圖3 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤細菌和真菌門水平相對含量

圖4 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤細菌和真菌門類水平聚類

15個樣品高通量測序后,共發現9個真菌門。在5個處理中,未確定分類門的真菌相對豐度變化范圍較大,相對含量4.56%～48.25%。除此之外,已確定的真菌門的相對含量51.75%～95.44%,說明根際土壤中已確定的真菌類群為中高水平,且5個處理中變化較大。根際土壤真菌前8個門分別為子囊菌門,相對含量34.58%～84.50%;擔子菌門,相對含量0.73%～40.92%;Rozellomycota,相對含量0.71%～14.91%;球囊菌門,相對含量0.14%～7.23%;Mucoromycota,相對含量0.02%～2.82%;Mortierellomycota,相對含量0.09%～1.02%;壺菌門,相對含量0.08%～0.78%;Basidiobolomycota,相對含量0%～0.02%。不同處理的真菌組成差異性較大,各處理中子囊菌占比均最大;在文椰3號單作土壤中,優勢真菌為子囊菌、擔子菌和球囊菌,其余的門占比較小;文椰4號間作、文椰2號間作1、文椰2號間作2中優勢真菌為子囊菌、擔子菌和Rozellomycota;文椰3號間作土壤中優勢真菌為子囊菌和Rozellomycota。文椰4號間作、文椰3號間作處理與文椰2號間作1、文椰2號間作2和文椰3號單作相比,Ascomycota占比顯著下降(p<0.05);文椰4號間作處理與其他處理相比,擔子菌占比顯著增加(p<0.05);文椰3號間作處理與其他處理相比,Rozellomycota相對豐度顯著增加,Basidiomycota占比顯著下降(p<0.05);文椰4號間作的根際土壤中Basidiomycota的相對豐度顯著高于文椰2號間作1、2和文椰3號單作、間作。

基于門水平的真菌聚類熱圖分析表明,文椰2號間作1、文椰2號間作2、文椰4號間作與文椰3號間作的真菌群落聚為一類,處于同一水平。文椰3號單作的真菌群落組成與其他處理相差較大,單獨聚為一類。

2.3 土壤微生物群落差異性分析

從圖5可以看出,對于細菌群落,文椰4號間作、文椰2號間作1和文椰2號間作2處理之間的距離較近,說明這3個處理的細菌群落相似度較高;文椰3號單作和文椰3號間作處理分別單獨位于1個區域,說明文椰3號單作、文椰3號間作與其他3個處理的細菌群落組成差異較大。不同處理椰子根際土壤細菌群落差異分析中主成分1和主成分2的貢獻率分別為67.07%和11.29%。

圖5 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤細菌和真菌主成分分析

對于真菌群落,文椰2號間作1和文椰2號間作2位于同一區域,說明同品種不同區域處理的真菌群落具有很高的相似性;其他處理各自位于1個區域,說明不同品種之間、間作和單作之間真菌群落組成差異性較大。不同處理椰子根際土壤真菌群落差異分析中主成分1(PC1)、主成分2( PC2)的貢獻率分別為33.84%和23.12%。

2.4 微生物群落與土壤理化因子的關系

從表3和圖6可以看出,椰子根際微生物細菌多樣性與椰子根際土壤含水量、電導率,有機質、全氮、堿解氮、全鉀、速效鉀、全磷、速效磷、有效鈣、有效鎂含量間呈顯著正相關(p<0.05),與根際土壤pH值間呈顯著負相關(p<0.05)。椰子根際土壤微生物真菌多樣性與土壤pH值、含水量、電導率,有機質、全氮、堿解氮、全鉀、速效鉀、全磷、速效磷含量間呈正相關(p>0.05),與有效鈣、有效鎂含量間呈負相關(p>0.05)。pH值與土壤含水量、電導率,有機質、全氮、堿解氮、全鉀、速效鉀、全磷、速效磷、有效鈣、有效鎂含量間呈顯著負相關(p<0.05);除pH值之外,土壤養分含量間呈顯著正相關(p<0.05)。

注:EC.電導率,OM.有機質,AN.堿解氮,AP.速效磷,AK.速效鉀,ACa.有效鈣,AMg.有效鎂。

表3 不同品種椰子間作菠蘿椰子根際土壤理化性質與細菌和真菌群落結構的相關性分析

冗余分析看出,pH值、有效鈣、速效鉀、速效磷是椰子根際土壤細菌的關鍵環境因子,其中pH值是文椰3號單作處理土壤細菌的最大影響因子。除有效鈣、速效鉀、速效磷外,文椰2號間作1處理土壤細菌還受有效鎂、有機質、電導率、堿解氮的影響。文椰3號間作、文椰2號間作2、文椰4號間作處理土壤細菌受土壤理化性質的影響較小。椰子根際土壤真菌群落受pH值的影響程度最大,是文椰3號單作處理土壤真菌的最大影響因子,文椰2號間作2、1處理土壤真菌則受到有效鈣、速效鉀、速效磷、有效鎂、有機質、電導率、堿解氮的影響。文椰4號間作、文椰3號間作處理土壤真菌受到土壤理化性質的影響較小。

3 結論與討論

試驗結果表明,椰子間作菠蘿顯著提高椰子根際土壤含水量、電導率,氮、磷、鉀、有效鈣和有效鎂含量,提高椰子土壤根際細菌豐度和多樣性,降低真菌豐度和多樣性。不同品種椰子間作菠蘿處理的根際土壤根際微生物組成及多樣性存在差異。間作模式中不同品種椰子的根際土壤微生物多樣性與土壤理化性質之間存在不同程度的相關性。

已有研究表明,對于土壤養分,間作的有效性比單作高,間作增加土壤供肥,改善根系對養分的吸收環境[13-15],改變土壤理化性質,使根際土壤微生物群落發生變化[16-19]。本研究中,間作處理顯著增加土壤含水量、電導率,有機質、氮、鉀、磷、有效鈣、有效鎂含量。相關性分析也表明細菌、真菌多樣性和組成與這些土壤養分呈正相關(p<0.05)。說明間作菠蘿可提高椰子根際土壤養分,間作對土壤微生物群落結構具有重要影響。

有機碳含量較高的作物系統促進土壤微生物多樣性[20],在陸地生態系統中,土壤微生物作為重要組成單元,在眾多生態過程中發揮著關鍵作用[21]。本研究中,相比于文椰3號單作處理,間作處理有機質含量均增加,細菌多樣性增加。文椰4號間作處理的細菌豐度和多樣性最高,文椰3號單作處理的土壤細菌多樣性最低,這說明文椰4號間作最有利于細菌群落的生長,間作提高了土壤細菌多樣性。文椰3號間作處理的土壤細菌豐度最低,且低于文椰3號單作,說明文椰3號間作降低土壤細菌豐度,不利于細菌數量增長;除此之外,其他間作模式相比于單作均可以增加根際土壤細菌豐度?？梢酝茰y椰子品種對于土壤根際細菌豐度有一定影響。

除文椰2號間作2處理外,文椰2號間作1、文椰4號間作、文椰3號間作處理真菌豐度均低于單作,即不同品種椰子對椰子根際土壤真菌生長影響不大,但是間作降低真菌豐度,這與陳慧等[22]發現植物品種對土壤根際真菌影響較大的情況相反。文椰2號間作2處理中土壤真菌豐度最大,表明只有該處理有利于真菌豐度增加,其他處理相比單作均降低真菌豐度。文椰3號間作處理的土壤細菌和真菌豐度都最小,該處理不利于根際土壤微生物生長,反而抑制其生長。微生物數量能指示土壤肥力,一般肥力越高,對應的細菌數也更高[23-24];而土壤真菌及放線菌數量越多,則表示土壤地力降低[25],作物生長受限。本研究中文椰4號間作處理可能提供最有利于椰子生長的微生態環境,而單作處理可能提供不利于椰子生長的環境。

不同處理的椰子根際土壤微生物主要以細菌為主,文椰4號間作處理的細菌類群最豐富,文椰2號間作2處理的真菌類群最豐富;文椰3號間作處理細菌和真菌的OTU均最低,微生物類群最貧乏,并且與其他處理的微生物組成存在較大差異。與單作相比,間作可以顯著增加土壤細菌豐度和多樣性,而降低真菌豐度和多樣性,這與喬月靜等[19]的研究一致。生境不一致,根系周圍分布的微生物群落自然也不同[26-27]。單作的土壤微生物群落主要受pH值的影響,間作則主要受到土壤有效鈣、速效磷、速效鉀、有效鎂、有機質、堿解氮等土壤養分的影響。

間作模式相比單作種植,根際土壤變形菌和擬桿菌占比均增加,酸桿菌占比下降,即間作模式有利于變形菌和擬桿菌生長,但不利于酸桿菌生長。相比于文椰2號間作1、2處理,文椰4號間作和文椰3號間作處理有利于擬桿菌生長,這可能主要取決于椰子品種,即文椰4號根系更有利于擬桿菌生長。文椰4號間作處理與其他處理相比,擔子菌占比顯著增加;文椰3號間作處理與其他處理相比,Rozellomycota豐度顯著增加,Basidiomycota占比顯著下降,未分類群占比大,不確定的真菌類種類高,均可能由于椰子品種是主因。

文椰4號間作、文椰2號間作1和文椰2號間作2的細菌群落相似度較高,表明文椰4號和文椰2號根際土壤微生物群落組成一致性較高,可能由于椰子品種以及間作模式共同作用引起。文椰2號間作1和文椰2號間作2處理,椰子品種相同,真菌群落相似性較高,而文椰4號間作、文椰3號間作和文椰3號單作真菌群落組成差異性較大。主成分分析也證實,主成分1和主成分2是不同品種椰子間作微生物群落的兩個最大差異特征,對細菌多樣性貢獻率分別為67.07%和11.29%,對真菌多樣性貢獻率分別為33.84%和23.12%。說明不是1個因素對同品種椰子間作土壤微生物產生影響,而是多因素共同作用的效應[28]。合理間作可以優化土壤微生物群落結構,使土壤向著良性健康的方向發展,較單作具有更顯著的根系效應。間作可能是促進土壤微生物多樣性和功能的好方法,土壤微生物群落在間作系統中具有潛在有益作用,同時也反映作物多樣性對于微生物群落的相對重要性[29-31]。