甘肅省武威市荷蘭豆根腐病病原菌種類的鑒定

張敏，劉永剛，李惠霞，石明明，韓變，Boakye Thomas Afriyie，喬萬強，魏雪娟

（1. 甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅省無公害農藥工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

荷蘭豆（Pisum sativumvar.saccharatum）屬豆科蝶形花亞科豌豆屬，是豌豆的變種，屬于軟莢豌豆［1］，又稱食莢豌豆。荷蘭豆作為重要的蔬菜種類主要食用嫩莢或嫩莖尖，生育周期短，含有大量的維生素、微量元素、胡蘿卜素及果糖等成分［2］，具有較高的食用價值和應用前景。武威市具有高海拔、無污染和光照充足等優勢，荷蘭豆的年種植面積超過1 300 hm2［3］，該地區生產的荷蘭豆作為高原夏菜的重要品種供應著我國南方的夏季蔬菜市場。

根腐病是豌豆的重要病害，一般造成減產10%～30%，重病地區可以減產60%，甚至絕產［4］。以前荷蘭豆根腐病在武威市偶有發生，但由于近年來大面積連作和抗病品種的缺乏，該病有加重的趨勢，制約了荷蘭豆產業的發展。目前對于荷蘭豆根腐病病原的研究尚未見報道，其病原是否與豌豆根腐病病原一致，尚不清楚。

據國外報道，豌豆根腐病病原有尖孢鐮孢菌Fusrium oxysporum［5］、燕麥鐮孢菌F.avenaceum與絲囊霉Aphanomyces euteiches［6］，其中以燕麥鐮孢菌引起的根腐病最為嚴重［7］。國內報道的病原菌有幾十種，包括茄病鐮孢菌F.solani［8］、尖孢鐮孢菌F.oxysporum［9］、木賊鐮孢菌F.equiseti、根串珠霉Thielaviopsis basicola、腐霉Pythiumspp.、立枯絲核菌Rhizoctonia solani與豌豆絲囊霉A.euteiches［10］等病原，其中尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌與豌豆絲囊霉［10］為優勢種類。甘肅省定西、榆中及平涼等地豌豆根腐病病原菌種類有多種［11-12］，其中以尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌與豌豆絲囊霉為優勢病種類［13］，但在武威市尚缺乏相關研究。

武威市是甘肅省荷蘭豆主要種植區域［14］，但尚未見根腐病病原的研究和報道，其病原菌和優勢種類尚不明確。針對這一現狀，本研究擬通過病原菌的分離和鑒定，以期明確武威市荷蘭豆根腐病病原及其優勢種類，為該病害的及時有效防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：2020～2021年，根腐病樣采集自甘肅省武威市天祝藏族自治縣荷蘭豆種植地。致病性測定用荷蘭豆品種為珍綠。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L；水瓊脂培養基（Water Agar，WA）：瓊脂15 g、自來水1 L；康乃馨葉片水瓊脂培養基（carnation leaves agar，CLA）：瓊脂15 g、蒸餾水1 L，在培養皿倒入培養基前加入10～15片滅菌康乃馨葉片（3～4 mm2）。

試劑：真菌基因組DNA提取試劑盒，無水乙醇、葡萄糖、瓊脂糖，均購于西安擎科生物技術有限公司（西安）。

1.2 試驗方法

1.2.1 荷蘭豆根腐病病原菌的分離純化 采用組織分離法分離荷蘭豆根腐病病原物。從植株病健交界處剪取約0.5 cm2病組織，用75%酒精浸30 s，無菌水沖洗3次后，用滅菌濾紙吸干，放置于PDA 上，于（25±1）℃培養箱中培養。采用單孢分離法純化病原菌：將孢子懸浮液稀釋至10倍鏡視野下有5～8個孢子，用1 mL無菌注射器將懸浮液轉移至WA培養基上，于（25±1）℃培養箱中培養。12 h后，用無菌針頭挑取萌發的孢子，于WA培養基培養。待純化后，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 荷蘭豆根腐病病原菌的形態學鑒定 將純化的菌株接種于PDA 與CLA 培養基上，置于（25±1）℃下全黑暗培養，7 d 后觀察其在PDA 培養基上的菌絲形狀和色素產生情況，并拍照記錄。在CLA 中放入滅菌的蓋玻片，15 d 后于顯微鏡下觀察CLA 培養基上分生孢子形態。形態學鑒定參考John.F Leslie 等［15］和王拱辰等［16］的方法，進行初步鑒定。

1.2.3 荷蘭豆根腐菌株基因組DNA 的提取 采用真菌基因組DNA試劑盒提取病原菌DNA。PDA培養基培養7 d后將菌絲刮下，在滅菌的研缽中加液氮研磨成粉末，具體試驗步驟參照試劑盒說明書進行。供試菌株的基因組DNA于-20 ℃保存，備用。

1.2.4 PCR 擴增和序列測定 利用rDNA-ITS序列引物ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）與翻譯延長因子TEF-1α 序列擴增引物EF-1H（5'ATGGGTAAGGAGGACAAGAC3'）和EF-2T（5'GGAAGTACCAGTGATCATGTT3'）進行PCR擴增，所用引物由西安擎科生物技術有限公司合成。

以供試菌株DNA為模板，用ITS1和ITS4引物對目標菌株ITS進行PCR擴增。擴增條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以dd H2O為陰性對照。擴增體系為25 μL（表1），擴增產物在1.0 %瓊脂糖凝膠上電泳20 min，凝膠成像系統中確認目的片段后，將PCR產物送西安擎科生物技術有限公司（西安）進行測序。測序結果于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST 比對，下載相似度較高的序列，使用BioEdit 7.0.5 進行比對分析，以Gibberella zeae（DQ459820）和Plectosphaerella cucumerina（EU594566）為外群，用MEGA 6.06以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，以確定病原菌的種類。

表1 目的基因序列PCR反應體系Table 1 DNA sequencing PCR reaction system

1.2.5 病原菌致病性測定 在甘肅農業大學溫室內進行致病性測定，試驗采用根部刺傷接種法。5%的次氯酸鈉浸泡后50 ℃水浴鍋中燙種15 min，30 ℃的溫水浸種4 h，將種子平鋪在托盤中催芽7 d，種子露白后種入花盆，待荷蘭豆苗子長至6 cm 左右進行致病性試驗。病原菌加無菌水洗脫孢子制成1×106個/mL的孢子懸浮液，組培瓶中裝入50 mL孢子懸浮液，以無菌水為對照。無菌針頭刺傷荷蘭豆根部，孢子懸浮液中浸泡12 h后，移栽至小花盆。每盆種植1 株，共16 個處理，1 個對照，每個處理重復3次。置于人工氣候箱中培養（18～25 ℃、16/8 光周期、3 000 lx），1 周后觀察發病情況。參考張麗娟等［17］的荷蘭豆根腐分級標準分級（表2），統計病原菌對荷蘭豆的發病率與病情指數。

表2 荷蘭豆根腐的病情分級標準Table 2 Disease classification standard of snow pea root rot

表3 16株鐮孢菌對荷蘭豆幼苗的致病性測定Table 3 Pathogenicity test of 16 strains of Fusarium spp.on snow pea seedlings

待植株發病后，按照1.2.1中的方法再次分離病原，觀察菌落、孢子形態，同時提取其DNA，PCR 擴增后測序后比對分析。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2007 與SPSS 19.0 軟件進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 荷蘭豆根腐病癥狀描述

荷蘭豆根腐病在田間零星分布。癥狀表現為病株生長緩慢，矮小，整個根系變褐，葉片發黃，越靠近地面葉片發黃愈加明顯。地上莖部表現枯黃，莖基部為紅褐色，根部逐漸變色，發病輕的植株仍可開花結莢，但籽粒不飽滿，嚴重植株地下莖及根部全部變成褐色至腐爛（圖1）。

圖1 武威市荷蘭豆根腐病田間癥狀Figure 1 Field symptoms of snow pea root rot in Wuwei City

2.2 荷蘭豆根腐病病原的分離結果

經分離純化，獲得16株鐮孢菌。根據菌落形態和色素、菌絲生長狀態及孢子形態，將鐮孢菌菌株初步歸為2組。

2.3 形態學鑒定

以菌株W2 為代表組，在PDA 平板上培養4 d后，菌落直徑為38.2～38.5 mm。菌落分布均勻，菌絲白色，稀疏，光滑有隔膜、分支。在CLA培養基上大型分生孢子單瓶梗產孢，無色紡錘形或鐮刀型，較寬、粗壯、直或彎曲，多數3 個隔膜，大?。?4.15～33.08）μm×（3.51～5.27）μm。小型分生孢子呈假頭狀，卵圓形、橢圓形或腎形，有隔或無隔，大?。?.207～11.212）μm×（2.079～3.881）μm；厚垣孢子無色，球形單生，多在菌絲中間或者短的側枝上形成（圖2）。依據上述形態特征，將W2、W4、W6、W1、W7、W13、W11、W9、W13-1、W12、W10、W8-1 與W8歸為一組，初步鑒定為茄病鐮孢菌F.solani。

圖2 茄鐮孢菌W8培養性狀與形態特征Figure 2 Cultural and morphological characteristics of Fusarium solani W8

以菌株W15 為代表組，在PDA 培養基上培養4 d 后，菌落直徑為34.7～35.7 mm。菌落中間土黃色，邊緣紫紅色，有明顯的同心輪紋。在CLA 培養基上，單瓶梗產孢，大型分生孢子鰻魚形，細長，頂細胞和足細胞明顯，多數5 個隔膜，大?。?7.31～68.51）×（3.14～4.19） μm。小型分生孢子呈卵形或棍棒形，0～1 隔，大?。?1.072～19.60）μm×（2.83～4.50） μm。依據上述形態特征將W15、W14與W14-1 歸為一組，初步將該組病菌鑒定為燕麥鐮孢菌F.avenaceum（圖3）。

圖3 燕麥鐮孢菌W14培養性狀與形態特征Figure 3 Cultural and morphological characteristics of Fusarium avenaceum W14

2.4 代表菌株分子生物學鑒定

2.4.1 rDNA-ITS 序列分析 采用通用引物ITS1/ITS4 擴增后測序，經GenBank 數據庫中BLAST 比對和MEGA 系統發育樹分析。結果表明，3個株菌的ITS序列聚為2支。第I組包括W1與W2 菌株，位于系統發育樹的同一支，該類菌與茄鐮孢菌F.solani的ITS 序列聚為一支，同源性最近，遺傳距離為0，登錄號分別為MK110648、EU263916、MH855484和MW710931，將其鑒定為茄病鐮孢菌。第II 組代表菌株W15 與燕麥鐮孢菌F.avenaceumOK331346 和MW016665 的ITS 序列聚為一支，與燕麥鐮孢菌的遺傳近距離為0，相似性為100%，故將其鑒定為燕麥鐮孢菌（圖4）。

2.4.2 基于EF-1α 序列的系統發育樹 以3 株代表菌株的DNA為模板，采用TEF-1α基因特異性引物EF-1H/EF-2T 擴增得到600 bp 左右的目的片段。經NCBI中比對分析，代表菌株與燕麥鐮孢菌與茄病鐮孢菌的相似度高達99%以上。利用MEGA構建系統發育樹與rDNA-ITS序列的系統發育樹結果相似。病原物聚為2類，第I類代表菌株W1和W2與茄鐮孢菌的TEF 序列聚為一個分支，同源性達99%，登錄號分別為MG857318 與MH822037，將其鑒定為茄病鐮孢菌。第II類代表菌株W15與燕麥鐮孢菌聚在一起，同源性為100%，登錄號分別為MK572748、MN958288、MK937121，與形態鑒定結果相符，將其鑒定為燕麥鐮孢菌（圖5）。

圖5 基于EF-1α序列構建荷蘭豆根腐病2種病菌與相關菌株的系統發育樹Figure 5 Phylogenetic tree of two pathogens and other related strains based on the EF-1α sequences

2.5 荷蘭豆根腐致病性測定

致病性試驗與根腐病田間癥狀基本一致（圖6）。從病株重新分離的病原菌經形態學和分子生物學鑒定，與接種的病原菌相同，符合柯赫氏法則。表明這16 株菌是荷蘭豆根腐致病菌，其病情指數為16.5～38，其中菌株W14-1病情指數最高為38，菌株W8病情指數最低為16.5。接種16 株病菌后，發病率為100%，而對照未發病。

圖6 16株鐮孢菌對荷蘭豆幼苗的致病性測定結果Figure 6 Results of pathogenicity test of 16 strains of Fusarium spp.on snow pea

3 討論

豌豆可分為軟莢豌豆和硬莢豌豆，硬莢豌豆即為豌豆，也叫糧用豌豆，以生產豌豆粒為主，但其嫩莢也可作蔬菜食用［1］。軟莢豌豆就是荷蘭豆，也叫食莢豌豆，主要以嫩莢作為蔬菜食用，一般不用于生產豌豆粒［18］。荷蘭豆與豌豆在外形上有明顯的差異，豌豆豆莢厚籽粒飽滿，顏色偏淺，豌豆花冠顏色多樣，多為紫色或紅色。荷蘭豆豆莢皮較薄，籽粒很小，外形呈扁平狀，豆莢顏色偏深綠，花冠顏色主要為白色，生育期較短，且收獲時間早于豌豆［19］。

目前，雖然有關豌豆根腐病病原的研究較多，但關于荷蘭豆根腐病病原種類尚未見報道。引起荷蘭豆根腐病的病原有多種，不同的地區病原和優勢種類不盡相同。國外報道籽用豌豆根腐病病原有尖孢鐮孢菌［20］、燕麥鐮孢菌與絲囊霉Aphanomyces euteiches［21］，以燕麥鐮孢菌為重要病原。目前國內已報道有數十種病原菌可以導致豌豆根腐病的發生，茄病鐮孢菌F.solani和尖孢鐮孢菌F.oxysporum是北京地區的優勢病原［9］，在青海茄病鐮孢菌和豌豆絲囊霉Aphanomyces euteiches具有較強致病力［10］，福建省豌豆根腐病由多種病原復合侵染，茄病鐮孢菌和絲囊霉致病力最強［22］。本研究在甘肅省武威市分離得到的荷蘭豆根腐病原為茄病鐮孢菌和燕麥鐮孢菌，以茄病鐮孢菌為優勢種類，這一結果與豌豆根腐病的病原不完全一致。甘肅省豌豆根腐病病原菌種類較多［23-24］，定西、榆中及平涼地區以茄病鐮孢菌、尖孢鐮孢菌與豌豆絲囊霉為豌豆根腐病優勢病原菌［12］。據孫順娣等［25］早期報道，甘肅省籽粒豌豆根腐病病原優勢種類為茄病鐮孢菌，說明茄病鐮孢菌分布較廣，既是豌豆根腐病，也是荷蘭豆根腐病的優勢病原。本研究發現燕麥鐮孢菌是引起武威市荷蘭豆根腐病病原之一，甘肅其他地區尚未見報道其是否為豌豆根腐病病原。試驗還發現，雖然燕麥鐮孢菌分離頻率較低，為18.75%，但個別菌株如W14-1 致病力較強，病情指數最高，為38.0。武威市是甘肅省燕麥主產區，而燕麥鐮孢菌是燕麥根腐病的主要病原菌［26］，推測該地區燕麥和荷蘭豆輪作可能是造成這一結果的原因之一。關于該地區荷蘭豆根腐病發生危害和造成的損失，病害的發生規律，及其病原種類與種植制度的關系還需要進一步調查研究。

鐮孢菌的形態復雜，在生長過程中形態變異較大，形態鑒定很難準確地將其鑒定到種［27］。隨著分子生物學的發展，將內轉錄間隔區ITS、線粒體小亞基核糖體mtSSU、β微管蛋白和翻譯延長因子TEF-1α 逐漸用于鐮孢菌的鑒定［28］，尤其以利用ITS 和TEF-1α 更為普遍［29］。TEF-1α 序列中EF-1α 位點核苷酸的替換率高，較ITS序列有較多的種間變異，對親緣關系較近的鐮孢菌有較高分辨力，是鐮孢菌屬真菌鑒定的有效方法［30］。目前，鐮孢菌的鑒定均采用在形態學觀察的基礎上，選擇特異基因片段對其進行鑒定，但對于鐮孢菌親緣關系較近的種和復合種，單一片段很難準確鑒定，還需挖掘更多的基因片段或多基因聯合才能更準確地鑒定［27］。本試驗利用形態學鑒定，ITS和TEF序列聯合分析的方法，鑒定了甘肅省武威市荷蘭豆根腐病的病原。其他研究者［31］也利用ITS和TEF序列聯合分析，鑒定辣椒根腐病原菌。

4 結論

本研究明確了甘肅省武威市荷蘭豆根腐病病原為茄病鐮孢菌與燕麥鐮孢菌，其中茄病鐮孢菌為優勢種類，分離頻率81.25%；燕麥鐮孢菌分離頻率為18.75%。室內致病性測定發病率為100%，病情指數為16.5～38.0，其中菌株W14-1 病情指數最高為38.0，菌株W8病情指數最低為16.5。