RORα在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

阿衣肯·巴合達提 胡爾西旦·那斯爾 張瑞麗 艾尼瓦爾·艾木都拉

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是十大惡性腫瘤之一,其發病率逐年升高[1]。腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)占RCC病例的70%～90%,是一種侵襲性較強的病理組織學亞型[2]。有研究表明,缺氧和缺氧相關的信號通路在RCC的發生和進展中起著重要作用[3]。隨著腫瘤細胞的增殖和生長,導致RCC缺氧,缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factors α, HIF-1α)響應缺氧被活化,并上調缺氧誘導基因的表達[4]。缺氧會上調維甲酸相關孤兒受體α(retinoid-related orphan receptor-alpha, RORα)基因在許多細胞類型中的表達,被證明是HIF-1的直接靶標[5-7]。因此推測RORα有望成為ccRCC治療的靶標,但其在ccRCC中的作用尚不明確。本研究對ccRCC組織中RORα蛋白的表達水平及其與臨床病理特征、預后之間的相關性進行分析,旨在為ccRCC的臨床診斷和治療提供理論依據。

對象與方法

一、臨床資料收集與隨訪

收集2014年12月至2019年12月在我院接受手術治療的ccRCC患者癌組織及對應癌旁組織標本151例。納入標準:①患者為首次就診;②未接受任何方式的抗腫瘤治療;③經病理組織學或細胞學檢查明確診斷為ccRCC。排除標準:①確診為腎癌,但不屬于ccRCC;②隨訪資料缺失,無法核實其病史等情況;③有抗腫瘤治療史;④有其他部位的原發惡性腫瘤史。通過調閱住院病歷、門診隨訪記錄以及電話隨訪,確定患者的死亡、復發時間。以局部進展、死亡為觀察終點,最后一次隨訪時間為2020年2月28日,隨訪3～62個月(中位時間36個月)。存活患者的生存期按截尾數據處理。手術日期至患者因疾病死亡的時間定義為總生存期,手術日期至患者疾病首次局部復發或者疾病進展的時間定義為無病生存期。

二、免疫組化及評估

將入組的石蠟包埋ccRCC及癌旁組織標本用0.3%(質量分數)過氧化氫溶液清除內源性過氧化物酶(15 min)后,加入1∶100一抗(兔抗RORα多克隆抗體由英國abcam公司提供)50 μl,將樣品與兔二抗在室溫下孵育30 min。然后用二氨基聯苯胺(DAB)染色,并用Meyer's蘇木精復染細胞核。染色評分參照文獻[8]標準判定,染色強度:0分為無著色或者著色不明顯,1分為輕度著色(淺黃色),2分為中度著色(深黃色),3分為重度著色(黃褐色或棕色);陽性細胞數:陽性細胞數0為0分,陽性細胞數≤25%為1分,陽性細胞數26%～50%為2分,陽性細胞數51%～75%為3分,陽性細胞數>75%為4分。將染色強度、陽性細胞數兩項的計分相乘,結果>4分判定為高表達,≤4分判定為低表達。

三、統計學方法

使用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料若滿足正態性檢驗則采用t檢驗,若不滿足則采用非參數檢驗;計數資料以構成比表示,組間比較采用χ2檢驗,不滿足χ2檢驗則采用Fisher精確檢驗;對研究隊列隨訪數據通過Kaplan-Meier法分析,采用Cox回歸模型分析影響預后的因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

151例隨訪患者中,存活144例(95.36%),死亡7例(4.64%),復發21例(13.91%),其中骨轉移9例(5.96%)、腹腔轉移2例(1.32%)、腎上腺及腎周圍組織轉移7例(4.64%)、肺轉移3例(1.99%)。將ccRCC組織中RORα表達水平按免疫組化評分結果分為高表達組和低表達組,其中64例為高表達,87例為低表達。ccRCC患者癌組織中RORα蛋白高表達率為42.38%(64/151),癌旁組織中RORα蛋白高表達率為68.87%(104/151),與癌組織比較,癌旁組織中RORα蛋白高表達率明顯較高,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。對ccRCC患者RORα蛋白表達水平與臨床病理特征的關系做進一步分析,結果顯示RORα蛋白表達與ccRCC患者的性別、TNM分期、Fuhrman分級、腫瘤直徑、臨床癥狀、淋巴結轉移、體質指數(body mass index, BMI)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平有關(P<0.05),而與年齡、腫瘤側別、糖尿病、高血壓、吸煙及胱抑素C(cystatin C, CysC)水平無關(P>0.05),見表2。對ccRCC患者的臨床資料及生化指標進行多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期為患者無病生存期和總生存期的危險因素(P<0.05),同時RORα表達水平與無病生存期有明顯相關性(P<0.05),見表3、4。

表1 ccRCC患者癌組織和癌旁組織中RORα表達情況[例(%)]

表2 ccRCC患者RORα表達與臨床病理特征之間的關系[例(%)]

表3 多因素Cox回歸分析患者無病生存期的影響因素

表4 多因素Cox回歸分析患者總生存期的影響因素

討 論

ccRCC是一種高度遺傳異質性的惡性腫瘤,發病隱匿,具有高轉移率和高死亡率[9]。轉移性ccRCC的治療以血管內皮生長因子抑制劑和免疫治療為主,但不同的患者對靶向治療的療效均存在較大差異[10],考慮與腫瘤特異性生物標志物有關[11]。因此,發現與ccRCC相關的新靶標是提高患者治療療效,實現精準治療的關鍵。

RORα作為維甲酸相關孤兒受體亞家族成員之一,通過結合目標基因的特異性DNA反應元件來調節轉錄,其廣泛表達于多種組織中,如腦、心臟、肝臟、肺、胃腸組織和胸腺、皮膚、子宮[12-13]。RORα基因是一個重要的生物鐘核心基因,參與人體代謝和晝夜節律的調節,在心血管疾病、慢性炎癥、免疫功能低下、細胞應激等病理過程中發揮著重要作用[14-16]。此外,有研究發現RORα在腫瘤的發生過程中起著重要作用[17-18]。在乳腺癌中觀察到RORα表達降低,RORα rs7164773 SNP與乳腺癌患者預后較差有關,RORα基因變異增加了患乳腺癌的風險[19]。在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中RORα是SORBS2的主要靶點,SORBS2通過直接結合RORα mRNA的3′UTR來減少RORα mRNA降解,并能在體內外抑制HCC細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化[20];也有文獻提出,miR-1246的上調和RORα的抑制是侵襲性HCC的顯著特征,miR-1246-RORα-Wnt/β-catenin軸是加速HCC進展的一種新途徑[21]。RORα在人胃癌組織與胃癌細胞系中均低表達,且RORα低表達與胃癌進展和預后不良有關[22]。RORα基因的過表達能夠抑制肺腺癌A549細胞的增殖活力,過表達RORα的A549細胞在裸鼠體內中成瘤能力降低,同時還可以激活P53/P21/CyclinB1信號通路[23]。本研究中,免疫組化檢測發現ccRCC組織中RORα蛋白表達下降,相較于早期患者(無淋巴結轉移及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期),進展期患者(淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期)癌組織中RORα蛋白高表達比例更低,這些結果表明RORα低表達患者的疾病進展及轉移可能性大,這與其他研究報道結果一致[15-23]。本研究對ccRCC患者RORα蛋白表達水平與臨床病理特征的關系做了進一步分析,結果顯示RORα蛋白表達與患者的性別、Fuhrman分級、腫瘤直徑、臨床癥狀、BMI、ALP水平存在顯著相關性(P<0.05),而與患者的年齡、腫瘤側別、CysC水平以及有無糖尿病、高血壓、吸煙無顯著相關性(均P>0.05)。本研究中RORα表達與臨床癥狀有關,出現臨床癥狀的患者RORα低表達占比升高,提示更長時間的病程和發生侵犯轉移的可能性,由此說明,RORα低表達與ccRCC的惡性病理特征相關即其表達與惡性程度成反比,也符合抑癌基因特點。早期研究已證實肥胖癥與眾多腫瘤的發生密切相關,幾乎一半的腎腫瘤與BMI>30 kg/m2的肥胖有關,BMI每升高5 kg/m2,腎癌風險增加20%～35%[24]。研究表明,超重和肥胖人群患腎癌風險分別增加35%和76%[25],本研究證實BMI≥25 kg/m2的患者RORα表達水平低,所以高BMI患者RORα的低表達性也符合RORα在ccRCC組織中低表達的特征。ALP主要由肝臟和成骨細胞合成,可作為生物標志物來評價肝臟和骨骼的功能。有研究認為ALP可作為預測和診斷惡性腫瘤骨轉移有意義的指標[26-27]。本研究151例ccRCC患者中有7例ALP含量偏高(≥216 U/L),均為RORα低表達患者。這也說明RORα低表達患者惡性程度高,容易發生骨轉移。

綜上所述,RORα蛋白在ccRCC組織中低表達,且與TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征相關,其低表達可能增加疾病進展及不良預后風險,有可能作為ccRCC患者診斷、治療及預后評估中的重要分子指標。