抗松材線蟲病馬尾松種源的抗性相關基因分析

鄭華英，徐麗麗，解春霞*，劉云鵬，葉建仁

抗松材線蟲病馬尾松種源的抗性相關基因分析

鄭華英1，徐麗麗1，解春霞1*，劉云鵬1，葉建仁2

(1. 江蘇省林業科學研究院，南京 211153；2. 南京林業大學林學院，南京 210037)

為了從轉錄組水平探討抗病馬尾松種源對松材線蟲的響應機制。以抗病馬尾松GD5種源為試驗材料，普通馬尾松SX1種源為對照，利用RNA-seq技術通過Illumina高通量測序平臺對松材線蟲誘導前后的試驗材料進行轉錄組測序和差異基因表達分析。試驗共獲得65 889條unigenes，平均長度為906.85 bp，其中40 478條（61.43%）unigenes基于Nr、GO、COG、KEGG等多個公共數據庫獲得了功能注釋?？共●R尾松GD5種源在接種松材線蟲后差異表達基因數量為3 247條，包括2 308條基因表達顯著上調，939條基因表達顯著下調。其中有1 961條（60.39%）差異表達基因被注釋到GO數據庫中，有504條（15.52%）差異表達基因被注釋到233 條pathway。普通馬尾松SX1種源在松材線蟲誘導過程中產生了更多的差異表達基因。兩個馬尾松種源富集的GO條目和pathway差異也較大?？共●R尾松GD5種源體內編碼醛脫氫酶的5條基因和編碼超氧化物歧化酶、過氧化物酶體原蛋白以及細胞色素b2的基因表達均顯著上調，醛脫氫酶基因不僅富集于抗壞血酸和醛酸代謝途徑中，還參與β-丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的代謝途徑；參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑的6條幾丁質酶基因表達均顯著上調；參與單萜生物合成的短鏈脫氫酶/還原酶2b及參與倍半萜和三萜生物合成的長葉烯合酶基因表達均顯著上調，而參與二萜類生物合成的1(10),5-格瑪吖啶-4-醇合酶、萜烯合酶、α-松油醇合酶、異丙二烯合酶以及2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶等表達均顯著下調?？共●R尾松GD5種源對松材線蟲的脅迫響應是多基因和多信號途徑共同參與調控的復雜防御反應，是全局性系統性的響應模式。與抗性相關的醛脫氫酶、幾丁質酶等編碼基因為后期相關抗性基因的研究提供了參考。

抗病馬尾松種源；松材線蟲??；轉錄組測序；抗性基因

松材線蟲?。╬ine wood nematode disease）是發生在松屬（spp.）樹種上的重大生物災害之一，能夠引起松樹大量死亡。由于該病涉及到寄主松樹、線蟲、天牛、真菌、細菌以及環境因素等多個方面，至今其致病機理尚未完全弄清，對其治理也較為被動，無論是物理清除、化學治理、還是生物防控，都較難達到理想的預防控制效果。因而對樹種本身的抗性差異進行研究，培育抗病松種（種源、品種、家系、無性系），可能成為松材線蟲病最有希望的防治途徑[1]。

馬尾松（）是中國松類中分布最廣、資源最豐富的鄉土樹種，也是南方19省區重要的荒山脊地造林樹種，受松材線蟲病的侵染為害十分嚴重。有研究表明馬尾松不同地理種源之間對松材線蟲病的抗病性有著明顯的差異[2-4]。徐福元等[5-6]經過十多年不定期接種觀測試驗，選出了來自不同地理區域的抗松材線蟲病馬尾松GD5等多個種源。對于馬尾松的抗松材線蟲病機制研究大多集中在生理生化層面，如萜類化合物、氨基酸等，而關于馬尾松抗松材線蟲病分子機制的研究報道較少。

RNA-Seq技術在植物抗病機制的研究中已得到廣泛應用[7-10]，在植物與線蟲互作的抗性機制研究方面也有很多成功的例子，如二穗短柄草（）與禾谷孢囊線蟲（）[11]、大豆品種（）與大豆胞囊線蟲（）[12-15]、桃砧木與南方根結線蟲（）[16]、馬尾松無性系與松材線蟲（）[17-18]等互作的抗性機制研究。本研究主要利用RNA-seq技術，通過Illumina高通量測序平臺，以期從轉錄組水平揭示抗病馬尾松GD5種源對松材線蟲的應答機制，為選擇具有抗性的馬尾松種源育苗造林提供科學依據，也為今后可能開展的轉基因育種打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以抗松材線蟲病馬尾松GD5種源為試驗材料，普通馬尾松SX1種源為對照。供試材料分別引自廣東信宜和陜西固城，均為2 年生實生苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 松材線蟲培養 用PDA培養基在培養箱（26 ℃±1 ℃）中培養灰葡萄孢菌（），待灰葡萄孢菌長滿培養皿后接入松材線蟲，置于培養箱中培養。待平板菌絲幾乎被食盡后，用無菌水將線蟲洗出，離心濃縮配制成約1 000 條·mL-1的線蟲懸液。

1.2.2 馬尾松樣本采集 2017年2月，從種源地引進供試材料，栽植于江蘇省林業科學研究院內的苗圃地。6月中旬，對試驗對象分別采集針葉，然后用刀片在馬尾松莖干上切一斜向下（長約0.5 cm，寬約1 cm）的傷口至木質部，傷口內塞入棉花至傷口填滿，在棉花上滴入松材線蟲懸液，接種量1 000 條/株。之后每天觀察馬尾松發病情況，待有針葉開始變色的病害癥狀出現時，對所有接種株再次采集針葉。每組試驗材料3個生物學重復。采集的針葉迅速放入液氮冷凍，—70 ℃保存。

1.2.3 馬尾松樣本總RNA提取與Illumina測序 將所有不同處理的馬尾松樣本分別提取RNA。采用Invitrogen公司提供的Plant RNA Purification Reagent試劑盒提取。RNA純度、濃度和完整性檢測方法分別為NanoDrop、Qubit和瓊脂糖凝膠電泳。測序RNA濃度≥20 ng·μL-1，總量≥2 μg，交由上海凌恩生物科技有限公司，采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法構建文庫。

1.2.4 數據處理 對測序獲得的原始數據經質量控制、組裝和拼接[19]后得到的馬尾松unigene序列分別與Nr、string、gene等數據庫比對，進行Nr、GO、COG、KEGG pathway（http://www.genome.jp/kegg/）等注釋。同時根據所有樣本與參考基因組的比對結果，以基因組的注釋文件作為參考，統計每個轉錄本在每個樣本中的RPKM值，以該值作為該轉錄本的表達量[20-23]。

1.2.5 馬尾松樣本差異基因分析 以FDR ≤ 0.05 && Foldchang≥2為標準篩選差異表達基因。利用GO（Gene Ontology, http://www.geneontology.org/）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）等公共數據庫對差異表達基因進行功能注釋。富集分析使用軟件Goatools（https://github.com/ tanghaibao/Goatools）和KOBAS（http://kobas. cbi.pku.edu. cn/ home.Do），并采用Fisher方法進行精確檢驗。同時采用Bonferroni、Holm、Sidak 和false discovery rate等4種多重檢驗方法對值進行校正，以控制計算的假陽性率，當經過校正的值（p_fdr）≤0.05時[24]，認為此GO、KEGG功能存在顯著富集情況。

2 結果與分析

2.1 馬尾松接種松材線蟲后的感病癥狀觀察

2017年6月中旬，對抗病馬尾松GD5種源和普通馬尾松SX1種源分別接種松材線蟲，之后每天觀察接種株的發病情況。結果顯示，接種后第14 天，SX1種源的接種株均開始出現不同程度的針葉失綠變色的癥狀，至30 d時，植株1/2以上的針葉變紅，至60 d時，均全株死亡；GD5種源的接種株則長勢良好，未出現任何感病癥狀，說明GD5種源的抗病性可靠。

2.2 馬尾松樣本轉錄組測序

以試驗材料轉錄組測序所用的RNA樣品共12份，總RNA等量混合后用于Illumina HiSeq 平臺測序。試驗共獲得65 889條unigenes，平均長度為906.85 bp，其中40 478條unigenes基于Nr、GO、COG、KEGG等多個公共數據庫獲得了功能注釋（表1），占總unigenes的61.43%；每種數據庫都有注釋的unigenes為6 904條，占總unigenes的10.48%。

表1 馬尾松樣本unigenes功能注釋信息統計

散點代表各個基因，紅色點表示顯著上調的基因，藍色點表示顯著下調的基因，黑色點為非顯著差異基因。下同。

Figure 1 Scatter plot and volcano map of GD5’ differential expression genes analysis inoculated with

2.3 馬尾松樣本差異表達基因分析

本試驗中，抗病馬尾松GD5種源在接種松材線蟲后差異表達基因數量為3 247條（圖1），其中包括2 308條基因表達顯著上調，939條基因表達顯著下調。普通馬尾松SX1種源在接種松材線蟲后差異表達基因數量為6 804條（圖2），其中包括4 226條基因表達顯著上調，2 578條基因表達顯著下調。比較發現， GD5種源有1 974條特異性差異基因上調表達、803條特異性差異基因下調表達，與SX1種源的相同差異基因470條，其中有366條基因表達趨勢相同，104條基因表達趨勢相反（圖3）。

圖2 普通馬尾松SX1種源接種松材線蟲前后基因差異表達分析散點圖及火山圖

Figure 2 Scatter plot and volcano map of SX1’ differential expression genes analysis inoculated with

圖3 馬尾松GD5和SX1種源接種松材線蟲前后的差異表達基因維恩圖(左：up；右：down)

Figure 3 Venn diagram of differentially expression genes of GD5 and SX1 inoculated with(left: up; right: down)

表2 馬尾松GD5和SX1種源相同顯著富集條目比較

2.4 馬尾松樣本差異表達基因GO功能富集分析

抗病馬尾松GD5種源和普通馬尾松SX1種源分別有60.39%和60.93%的顯著差異表達基因在GO數據庫中注釋，均顯著富集于生物學過程、細胞組分和分子功能中。對比兩個馬尾松種源的GO-term，經p_fdr矯正后的相同顯著富集條目41條。但是兩個種源間的差異基因在相同條目的分布是有差異的（富集顯著差異基因數量超20%的GO-term見表2），例如抗病馬尾松GD5種源和普通馬尾松SX1種源分別有1 793條和3 759條差異基因分布到生物過程，又如應激反應分別有906條和1 598條差異基因富集。經p_fdr矯正的抗病馬尾松GD5種源特異性顯著富集條目63條，如發育進程developmental process（409 genes）、解剖結構anatomical structure（380 genes）、作用于蛋白質的催化活性catalytic activity，acting on a protein（286 genes）、對外部生物刺激的反應response to external biotic stimulus（280 genes）、對其他生物體的反應response to other organism（275 genes）、蛋白質修飾過程protein modification process（275 genes）、細胞蛋白修飾過程cellular protein modification process（274 genes）、防御反應defense response（220 genes）、信號傳導signaling、激酶活性kinase activity（164 genes）；普通馬尾松SX1種源特異性顯著富集條目449條，如胞內細胞器intracellular organelle（2 712 genes）、代謝過程metabolic process（2 589 genes）、膜結合細胞器membrane-bounded organelle（2 431 genes）、細胞內膜結合細胞器intracellular membrane-bounded organelle（2 400 genes）、胞內代謝過程cellular metabolic process（2 272 genes）、有機物代謝過程organic substance metabolic process（2 264 genes）、初級代謝過程primary metabolic process（1 987 genes）、細胞分裂素Cytoso（1 857 genes）、線粒體mitochondrion（689 genes）、小分子代謝過程small molecule metabolic process（651 genes）。

圖4 抗病馬尾松GD5種源差異表達基因KEGG富集圖

Figuer 4 KEGG enrichment map of GD5’differentially expression genes

2.5 馬尾松樣本差異表達基因 KEGG富集分析

抗病馬尾松GD5種源有15.52%的顯著差異表達基因被注釋到233條pathway中（圖4），其中包含顯著上調基因398條，顯著下調基因106條，經p_fdr矯正顯著富集的pathway有4條，為類黃酮生物合成Flavonoid biosynthesis（32 genes）、內質網蛋白質加工Protein processing in endoplasmic reticulum （44 genes）、蛋白質消化和吸收Protein digestion and absorption（8 genes）和亞油酸代謝Linoleic acid metabolism（12 genes）。普通馬尾松SX1種源有14.42%的顯著差異表達基因被注釋到272條pathway中（圖5），其中包含顯著上調基因702條，顯著下調基因條279，經p_fdr矯正顯著富集的pathway有2條，為光合作用Photosynthesis（24 genes）和亞油酸代謝Linoleic acid metabolism（18 genes）。

圖5 普通馬尾松SX1種源差異表達基因KEGG富集圖

Figure 5 KEGG enrichment map of SX1’ differentially expression genes

兩個種源相同的pathway為223條，但富集的基因及數量并不完全相同。如在GD5種源樣本中顯著富集的內質網中的蛋白質加工Protein processing in endoplasmic reticulum、蛋白質消化和吸收Protein digestion and absorption、植物-病原相互作用Plant-pathogen interaction、黃酮和黃酮醇生物合成Flavone and flavonol biosynthesis、抗原加工和呈遞Antigen processing and presentation、植物晝夜節律Circadian rhythm – plant、MAPK信號通路MAPK signaling pathway、二萜生物合成Diterpenoid biosynthesis、雌激素信號通路Estrogen signaling pathway、碳水化合物消化和吸收Carbohydrate digestion and absorption、礦物質吸收Mineral absorption等pathway，在SX1中富集不顯著。GD5種源和SX1種源在Flavonoid biosynthesis均顯著富集，但比較發現，GD5種源在該pathway富集的32條差異基因中有22條為特異表達基因，10條相同的差異基因有8條表達趨勢相異，在GD5種源中為下調表達，在SX1種源中則為上調表達。GD5種源特異性富集pathway有近端小管碳酸氫鹽回收Proximal tubule bicarbonate reclamation 、黃曲霉毒素生物合成Aflatoxin biosynthesis、單萜類生物合成Monoterpenoid biosynthesis、倍半萜和三萜類生物合Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis、泛酸和輔酶A生物合成Pantothenate and CoA biosynthesis、葉酸碳池One carbon pool by folate、其他聚糖降解Other glycan degradation、DNA復制DNA replication等，除Proximal tubule bicarbonate reclamation和Aflatoxin biosynthesis顯著富集外，其他pathway富集均不顯著。

表4 抗病馬尾松GD5種源接種松材線蟲后與氨基酸代謝相關基因表達差異統計

續表4

表5 抗病馬尾松GD5種源接種松材線蟲后與萜類物質生物合成相關基因表達差異統計

2.6 抗病馬尾松GD5種源抗氧化脅迫類基因

抗病馬尾松GD5種源在接種松材線蟲后有8條具有解毒作用的酶基因顯著上調表達（表3），包括TRINITY_DN17586_c0_g1、TRINITY_ DN27148_ c0_g1、TRINITY_DN30374_c0_g1、TRINITY_ DN39430_c0_g1、TRINITY_DN39430_c1_g1等醛脫氫酶（顯著富集在抗壞血酸和醛酸代謝途徑中），TRINITY_DN36781_c0_g1超氧化物歧化酶、TRINITY_DN53743_c0_g1過氧化物酶體原蛋白和TRINITY_DN48123_c0_g2細胞色素b2；TRINITY_DN62269_c2_g4谷胱甘肽過氧化物酶則顯著下調表達。與普通馬尾松SX1種源相比較，GD5種源有5條特異性差異表達基因，另有4條基因在SX1種源接種松材線蟲后表達也有變化，除TRINITY_DN53743_c0_g1基因顯著下調外，其他基因表達變化并不明顯。由此可見，GD5種源在受松材線蟲脅迫下，通過上調具有解毒功能的酶相關基因表達，來提高植株對外源有毒物質的解毒效率，鈍化外源有毒物質對植株的傷害。

2.7 抗病馬尾松GD5種源與氨基酸代謝相關基因

抗病馬尾松GD5種源接種松材線蟲后與氨基酸代謝相關的顯著差異表達基因有52條（表4），其中45條基因上調表達，7條基因下調表達。與普通馬尾松SX1種源比較發現， GD5種源共有18條特異性差異表達基因，其余34條基因與SX1種源相同，但其中17條在SX1種源中表達變化不明顯，另17條有2條基因在GD5種源中顯著下調和15條基因顯著上調，而在SX1種源中均顯著上調。

TRINITY_DN17586_c0_g1、TRINITY_DN27148_ c0_g1、TRINITY_DN30374_c0_g1、TRINITY_ DN39430_c0_g1、 TRINITY_DN39430_c1_g1等醛脫氫酶家族基因參與β-丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸等氨基酸的代謝，均顯著上調表達。與SX1種源比較，除TRINITY_DN27148_c0_g1在SX1種源中表達變化不明顯外，其他均為GD5種源特異性差異表達基因。

參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑的基因主要為TRINITY_DN14766_c0_g1、TRINITY_DN42740_c0_ g1、TRINITY_DN60686_c8_g1、TRINITY_DN62541_ c5_g5、TRINITY_DN64440_c0_g11、TRINITY_ DN64440_c0_g5等幾丁質酶基因，顯著上調表達；TRINITY_DN59376_c0_g1甘露糖焦磷酸化酶基因則顯著下調表達。在SX1種源中， TRINITY_ DN59376_c0_g1和TRINITY_DN60686_c8_g1表達變化不明顯外，其他幾丁質酶基因也都顯著上調表達。

GD5種源中與氨基酸代謝相關的其他基因還參與酪氨酸、氰胺酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸等一至多條氨基酸代謝途徑。

以上結果表明：GD5種源與氨基酸代謝相關的差異表達基因大部分顯著上調，推測這些基因加速了馬尾松體內部分氨基酸種類的分解，其含量較接種松材線蟲前呈明顯下降趨勢，但也有部分氨基酸種類可能因為氨基酸合成途徑的編碼基因顯著上調表達，使生物合成和降解達到一個相對平衡的狀態，從而其含量變化不明顯或者有提高趨勢。編碼幾丁質酶的基因參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，這些幾丁質酶基因同樣上調表達，推測在馬尾松抵御松材線蟲的侵染過程起到一定的積極作用。

2.8 抗病馬尾松GD5種源與萜類物質生物合成相關基因

由表5可見，抗病馬尾松GD5種源在接種松材線蟲后有1條顯著上調差異基因TRINITY_ DN23660_c0_g2羥甲基戊二酰輔酶A合成酶與萜類骨架生物合成有關；1條顯著上調差異基因TRINITY_DN46914_c0_g1短鏈脫氫酶/還原酶2b參與單萜生物合成；1條顯著上調差異基因TRINITY_DN58117_c2_g1長葉烯合酶參與倍半萜和三萜生物合成；以上3條基因在普通馬尾松SX1種源接種松材線蟲后表達變化不明顯。GD5種源有6條顯著下調差異基因TRINITY_DN26974_c0_g2、TRINITY_DN39339_c0_g1、TRINITY_DN57879_c1_ g1、 TRINITY_DN58620_c0_g1、TRINITY_ DN64492_ c1_g1、TRINITY_DN65919_c1_g2參與二萜生物合成，分別為1(10),5-格瑪吖啶-4-醇合酶、萜烯合酶、α-松油醇合酶、異丙二烯合酶、2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶等，與SX1種源相比較，其中有4條為GD5種源特異性差異表達基因，另外2條基因在SX1種源接種松材線蟲后表達也有變化，但不明顯。以上結果表明：GD5種源在接種松材線蟲后單萜、倍半萜和三萜物質含量提高，二萜類物質含量下降，可能在馬尾松抵御松材線蟲的入侵過程中起正負調節的作用。

3 討論與結論

植物體中功能基因在不同環境條件下的動態表達是揭示植物對生物學響應機制的重要過程，明確該過程對了解植物應對環境變化的適應調節機制具有十分重要的意義。松材線蟲侵染往往導致非抗病松樹的最終枯萎死亡，而在這一過程中存在著信號轉導、抗逆防御、代謝等相關基因的表達變化過 程[18,25-27]。許多研究已經證實，超氧化物歧化酶、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶、谷胱苷肽s轉移酶（GST）等作為防御酶，可清除植物體內因受病原物侵染而造成的活性氧累積，保護植物細胞免遭氧化損傷，在植物抗病反應中發揮著重要作用[28-32]?？共●R尾松種源在接種松材線蟲后POD活性能在較長時間內維持，并產生兩個活性較高的峰值，而敏感種源POD活性則迅速降低，且明顯低于抗病種源，且抗病種源活性升高的酶帶數量多于敏感種源[32]。本研究發現，抗病馬尾松GD5種源體內編碼醛脫氫酶的5條基因富集于抗壞血酸和醛酸代謝途徑中，和編碼超氧化物歧化酶、過氧化物酶體原蛋白以及細胞色素b2的基因均顯著上調，推測這些具有解毒功能的酶相關基因的表達變化提高了馬尾松對松材線蟲脅迫引起的外源有毒物質的解毒效率，鈍化了外源有毒物質對植株的傷害。

據報道植物體內氨基酸含量與植物抗病蟲害的能力有關，研究發現抗病馬尾松種源在接種松材線蟲前后均比敏感馬尾松種源含有較少的組氨酸等9種游離氨基酸[33]。本研究發現，表達顯著上調的醛脫氫酶基因不僅參與抗壞血酸和醛酸代謝途徑，還參與β-丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的代謝途徑，其他參與氨基酸代謝途徑的基因大多也都顯著上調表達，推測醛脫氫酶等基因的顯著上調表達加速了馬尾松體內部分氨基酸種類的分解，其含量較接種松材線蟲前呈明顯下降趨勢；但也有部分氨基酸種類可能因為氨基酸合成途徑的編碼基因顯著上調表達，使生物合成和降解達到一個相對平衡的狀態，從而其含量變化不明顯或者有提高趨勢。同時還發現，編碼幾丁質酶的基因參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑。植物幾丁質酶具有抑制真菌、細菌生長以及抗蟲的作用，正常情況下植物幾丁質酶含量較低，經病原物侵染誘導后其基因會大量表達，迅速積累[34]。本試驗中，這些幾丁質酶基因均上調表達，推測在GD5種源抵御松材線蟲的侵染過程起到一定的積極作用。

馬尾松體內的萜類化合物與松材線蟲的生存和繁殖密切相關，研究發現抗病馬尾松種源比敏感馬尾松種源含有更多的長葉烯，而含較少的二萜類中性化合物[35-36]；單萜含量也與馬尾松抗病程度呈正相關關系[17]。本研究發現，抗病馬尾松GD5種源在接種松材線蟲后，參與單萜生物合成的短鏈脫氫酶/還原酶2b及參與倍半萜和三萜生物合成的長葉烯合酶基因均顯著上調，而參與二萜類生物合成的1(10)、5-格瑪吖啶-4-醇合酶、萜烯合酶、α-松油醇合酶、異丙二烯合酶以及2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶等均顯著下調，與文獻報道基本一致，推測在GD5種源抵御松材線蟲的入侵過程中不同萜類物質的調節作用不完全相同。

由此可見，抗病馬尾松GD5種源對松材線蟲的脅迫響應是多基因和多信號途徑共同參與調控的復雜防御反應，是全局性系統性的響應模式。試驗獲得的編碼醛脫氫酶的TRINITY_DN17586_c0_g1、TRINITY_DN27148_c0_g1、TRINITY_DN30374_c0_ g1、TRINITY_DN39430_c0_g1、TRINITY_DN39430_ c1_g1等5條基因不僅富集于抗壞血酸和醛酸代謝途徑中，還參與β-丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸的代謝途徑；RINITY_DN14766_c0_g1、TRINITY_DN42740_c0_g1、TRINITY_DN60686_c8_g1、TRINITY_DN62541_c5_g5、TRINITY_DN64440_c0_ g11、TRINITY_DN64440_c0_g5等6條幾丁質酶基因則參與氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，這些與抗性相關的醛脫氫酶、幾丁質酶等編碼基因為后期相關抗性基因的研究提供了參考。

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Analysis of resistance genes inprovenances against pine wood nematode disease

ZHENG Huaying1，XU Lili1，XIE Chunxia1，LIU Yunpeng1，YE Jianren2

(1. Jiangsu Academy of Forestry, Nanjing 211153; 2.School of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)

To investigatethe response mechanism of PWD-resistantprovenance to pine wood nematode at transcriptome level. Using disease-resistant provenance-GD5 ofas test materials and normal provenance-SX1 ofas control, the transcriptome profiles analysis of test materials before and after infected bywere sequenced by RNA-seq technology using Illumina sequencing platform, and the differentially expressed genes were analyzed. The result showed that: 65 889 unigenes were obtained, of which 40 478 (61.43%) unigenes were identified in NR, GO, KEGG, Swiss-Prot COG and the other databases in total. The average length is 906.85 bp. In GD5, the number of differentially expressed genes (DEGs) were 3 247, including 2 308 up-regulated genes and 939 down-regulated genes, 1 961 DEGs （60.39%）were annotated into the go database and 504 DEGs（15.52%）were annotated into 233 pathways. SX1 occupied more DEGs after infected by. The GO and KEGG terms exhibited big differences between the two provenance pines. Aldehyde dehydrogenase, superoxide dismutase, peroxisome biogenesis protein 1 and cytochrome b2, mitochondrial-like were significantly up-regulated. The aldehyde dehydrogenase genes were not onlyenriched in ascorbic acid and aldehyde metabolism pathway, but also involved in the metabolism of amino acids such as β - alanine, lysine, tryptophan, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine and proline. Six chitinase genes involved in the metabolism of amino sugar and nucleotide sugar were significantly up-regulated. Dehydrogenase/reductase 2b-like involved in monoterpenoid biosynthesis and longifolene synthetase involved in sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis were significantly up-regulated, while 1 (10),5-germacradien-4-ol synthase, terpene synthase, α-terpineol synthase, isopimaradiene synthase and 2-methyl-3-buten-2-ol synthase involved in diterpenoid biosynthesis were significantly down-regulated. The stress response of GD5 to pine wood nematode is a complex defense response that involves multiple genes and multiple signal pathways, and it is a global and systematic response mode. The coding genes such as aldehyde dehydrogenase and chitinase related to resistance provide a reference for the study of related resistance genes in the later stage.

PWD-resistantprovenance; Pine wood nematode disease; RNA-seq; Resistance genes

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.006

2023-06-26 16:19:55

S791.248

A

1672-352X (2023)03-0379-10

2022-06-14

國家重點研發計劃 (2017YFD0600104)資助。

鄭華英，博士，副研究員。E-mail：zhenghuay78@126.com

通信作者:解春霞，研究員。E-mail：593644976@qq.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1457.012.html