小麥田日本看麥娘對唑啉草酯的抗藥性機制研究

萬永樂，戴玲玲，邢雨誠，孫倩倩，項 晶，畢亞玲*

小麥田日本看麥娘對唑啉草酯的抗藥性機制研究

萬永樂1，戴玲玲1，邢雨誠2，孫倩倩1，項 晶1，畢亞玲2*

(1. 安徽科技學院資源與環境學院，鳳陽 233100；2. 安徽科技學院農學院，鳳陽 233100)

為明確小麥田日本看麥娘對唑啉草酯的抗藥性情況及潛在的抗藥性機制，應用整株生物測定法測定了采自安徽省、江蘇省多個日本看麥娘發生嚴重地區共19個日本看麥娘種群對唑啉草酯的抗藥性水平，并選取6個高抗種群進行基因測序和GSTs活性測定，比較抗藥性、敏感種群間的基因序列和GSTs活性差異，同時測定了AH-29對其他8種除草劑的敏感性。結果顯示，9個日本看麥娘種群對唑啉草酯產生了高水平抗性，占被測總數的47.37%，抗性指數在12.70 ～ 38.77之間；種群AH-28、AH-29和JS-15的基因CT區域第1781位異亮氨酸（ATA）突變為亮氨酸（TTA），種群AH-36和JS-16第2027位色氨酸（TGG）突變為半胱氨酸（TGT），種群AH-34未發現突變；6個高抗種群體內GSTs活性經唑啉草酯處理后均明顯高于同處理敏感種群AH-7；種群AH-29均對ACCase抑制劑炔草酯、烯草酮以及ALS抑制劑的甲基二磺隆和氟唑磺隆產生了高水平抗性，抗性指數分別為45.32、29.54、37.53和23.04；對三甲苯草酮產生了中水平抗性，對雙草醚和啶磺草胺表現低抗，但對PSII抑制劑異丙隆較為敏感。研究表明，基因突變與GSTs活性增強是導致日本看麥娘種群對唑啉草酯產生抗藥性的重要原因之一。

日本看麥娘；唑啉草酯；江淮地區；抗藥性；交互抗性

日本看麥娘是我國麥田主要惡性禾本科雜草，具有抗逆性強、分蘗旺盛等競爭優勢，在黃河及長江中下游流域等地的稻麥輪作區危害十分嚴重[1-2]。目前，生產上仍以化學防除為主[3]。乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACCase）抑制劑類除草劑通過減少雜草體內ACCase參與的羧化反應，使其合成脂肪酸受阻而死亡，具有活性高、毒性低、選擇性強等優點，被廣泛用于麥田防除禾本科雜草[4-5]。但隨著其長期、大量使用，加之作用靶標位點單一，導致多種禾本科雜草逐漸對其產生抗藥性[6]。自1986年首次發現澳大利亞硬直黑麥草對該類除草劑產生抗藥性以來，截至2022年5月，全球已有50種雜草對ACCase類除草劑產生了抗藥性[7-8]。

現關于雜草抗ACCase類除草劑機理的研究多集中在靶標抗性（TSR）和非靶標抗性（NTSR）兩方面[9-11]。靶標抗性主要是雜草體內酶基因發生突變而產生。目前已證實有7個基因突變位點氨基酸可以發生改變，分別為第1781、 1999、2027、2041、2078、2088和第2096位，且同一位點發生不同的氨基酸突變類型可導致對不同除草劑產生抗藥性[12-13]。非靶標抗性主要是雜草代謝解毒機制通過增強GSTs和P450等代謝酶系的活動完成，使得雜草體內到達靶標酶的除草劑分子數量減少，從而減輕對雜草的傷害[14]。

唑啉草酯（pinoxaden）是先正達公司研發的一種新苯基吡唑啉（phenylpyrazoline, PPZ）類除草劑，因其作用靶標既不同于ALS類除草劑，雖同為ACCase抑制劑類除草劑，但作用位點不同于芳氧苯氧基丙酸酯類（aryloxyphenoxypropionates, APP）和環己烯酮類（cyclohexanediones, CHD）除草劑，被廣泛用于小麥田中防除已產生抗藥性的禾本科雜草[15-16]。但近年來，本課題組于田間雜草調查時發現，江淮部分地區唑啉草酯已不能對日本看麥娘進行有效防除，可能與其對唑啉草酯產生抗藥性有關。目前，畢亞玲[17]、李蓉榮[18]等曾有關于對日本看麥娘對唑啉草酯產生交互抗性的報道，而其具體產生抗藥性的機制還未見闡述。為此，本研究在江淮地區日本看麥娘發生嚴重的小麥田采集部分日本看麥娘種群，明確其對唑啉草酯的抗藥性水平、比較抗藥性與敏感種群的基因序列和GSTs酶活性差異，同時測定了其對不同類型除草劑的抗藥性情況，旨在為小麥田抗藥性日本看麥娘綜合治理及除草劑科學合理施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

日本看麥娘種子：2019年在江淮不同區域小麥田采集19個日本看麥娘種群；敏感種群AH-7為實驗室已知的日本看麥娘種群[17]，采集自安徽省滁州市鳳陽縣非耕地，該地塊從未使用過除草劑。ACCase抑制劑用藥背景等具體信息詳見表1，供試除草劑及劑型見表2。

表1 日本看麥娘各種群種子采集地點

試劑和儀器：Tris-HCl，上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine- tetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na）和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, CTAB），國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone, PVP），上海晶純試劑有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH），上海藍季試劑有限公司；2, 4-二硝基氯苯（CDNB），上海浩然生物技術有限公司；SHP-150生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；HCL-2000行走式噴霧塔，昆山恒創力科技有限公司；TP-96G PCR擴增儀，德國耶拿分析儀器股份公司；GTR10-2高速冷凍離心機，日立（中國）有限公司；JY600E電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司。

表2 供試除草劑及施藥劑量

注:加下劃線的數字表示該藥劑的田間推薦劑量。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗藥性水平測定 采用整株水平生物測定法，參照《農藥室內生物測定試驗準則》GB NY/T 1155.4—2006進行[19]。分別選取足量、飽滿度相對一致的日本看麥娘種子，放在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，置于生化培養箱內（光照（L/D）=12 h/12 h；溫度：25 ℃/15 ℃）催芽，待多數試材露白后，每盆固定15粒播種到裝有4/5體積基質的塑料盆中（直徑12 cm，高10 cm），覆土0.5 ～ 1.0 cm。在溫室內（溫度10 ～ 22 ℃、相對濕度55% ～ 70%）進行培養，采用盆底滲吸的方式使土壤保持濕潤。待日本看麥娘一葉一心期，每盆間苗至10株。

供試劑量參照預試驗結果，按等比比例設計濃度，具體劑量見表2。藥劑配制根據濃度設定，用清水定容配制成高濃度母液，使用母液稀釋梯度法稀釋至所需濃度，各種群均單獨設置空白對照，噴施等量清水，每處理設4次重復。待日本看麥娘長至三葉一心，使用HCL-2000型號行走式噴霧塔均勻噴霧，扇形噴頭距葉片最高點50 cm，噴液壓力275 kPa，噴霧量450 L·hm-2，噴藥后繼續將幼苗放于溫室培養。藥后21 d，剪取植株地上部分置于80 ℃烘箱中烘至重量不再變化，稱取干重并計算干重抑制率，干重抑制率/%=（對照干草重﹣處理干草重）/對照干草重×100。

1.2.2 抗藥性、敏感日本看麥娘種群基因檢測 依據抗藥性水平測定結果，選取6個高抗種群（AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15和JS-16）和1個敏感種群（AH-7）進行基因檢測。日本看麥娘培養和施藥方法同1.2.1。待日本看麥娘長至三葉一心時，采用CTAB法[20]對各種群幼嫩葉片進行DNA提取。由已知的日本看麥娘基因序列（JQ068820.1）設計引物（-F: 5'-TTTC CCAGCGGCAGACAGAT-3'，-R: 5'-TCCCTGG AGTCTTGCTTTCA-3'）進行PCR擴增。反應體系共25 μL，包括：9.5 μL的ddH2O，12.5 μL 2 ×MasterMix，1 μL基因組DNA，10 μmol·L-1的前引物和后引物各1 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，34個循環；72 ℃終延伸10 min?；厥誔CR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的條帶的凝膠送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。參照大穗看麥娘的氨基酸序列全長(AJ310767)，使用DNAMAN 5.2.2軟件比對測序結果的堿基差異。

1.2.3 GSTs活性測定 為進一步明確唑啉草酯對日本看麥娘體內GSTs活性的影響，供試種群同1.2.2，試驗方法同1.2.1。唑啉草酯施藥量為45 g (a.i.)·hm-2，空白對照噴施等量清水，設4次重復。分別于藥后0、1、3、5、7、9和12 d剪取各種群地上部分幼嫩組織，并放入﹣80 ℃冰箱保存備用。

GSTs粗酶液提?。呵腥?.5 g葉片并加入液氮進行研磨，待葉片組織成粉狀后加入8 mL提取液繼續研磨，提取液主要成分有0.1 mol·L-1Tris-HCl、5% PVP（）和25 mmol·L-1還原型GSH，pH值為8.0。研磨完成后，1 690×g離心10 min，取上清液。

GSTs活性測定：根據畢亞玲[21]等方法，取0.1 mL粗酶液和3 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液至具塞管中水浴保溫10 min，溫度為25 ℃，再加入0.1 mL 13 mmol·L-1的CDNB測定液反應10 min，測量340 nm處的吸光度值，計算GSTs活性。GSTs活性[nmol·（min-1·mg-1）] = 吸光度值×1 000/（粗酶液蛋白質濃度×9.5）。通過處理組GSTs活性與同日對照組GSTs活性的比值得出GSTs相對活性。

1.2.4 日本看麥娘對其他除草劑的敏感性測定 依據抗藥性水平測定結果，選取抗藥性最高種群AH-29，按照1.2.1所述方法，分別測定其與敏感種群AH-7對8種除草劑的敏感性，具體施藥劑量見表2。

1.3 數據處理

使用Origin 2018對日本看麥娘GSTs相對活性進行比較，DPS 7.05軟件進行數據分析，以日本看麥娘干重抑制率幾率值（）與施藥量對數值（）建立回歸方程（= a + b），并計算各藥劑對各種群的有效中量（GR50）和95%置信限?？剐灾笖担╮esistance index，）= 抗藥性種群GR50/敏感種群GR50。分級標準如下，敏感，＜2；低水平抗性，2≤＜5；中水平抗性，5≤＜10；高水平抗性，≥10.00[22]。

2 結果與分析

2.1 不同日本看麥娘種群對唑啉草酯抗藥性水平

供試20個日本看麥娘種群中，除已知敏感種群AH-7外，9個種群對唑啉草酯表現出高水平抗性，占種群總數的47.37%，GR50在100.24 ～ 305.88 g (a.i.) ·hm-2之間，與敏感種群相比，抗性指數在12.70 ～ 38.77之間。剩余中抗種群為4個，低抗種群為1個，5個種群仍對唑啉草酯表現敏感（表3）。

M：DNA Marker DL2000。

Figure 1 Amplification of fragments ofgenes

表3 不同日本看麥娘種群對唑啉草酯的抗藥性水平

2.2 抗藥性、敏感日本看麥娘種群ACCase基因差異

引物擴增區域包含已證實的7個氨基酸堿基突變位點，基因擴增序列長度為1 437 bp，序列比對結果顯示種群AH-7、AH-28、AH-29、AH-34、AH-36、JS-15和JS-16的基因擴增片段與GenBank登錄的質體型基因（JQ068820.1）的同源性分別為99.83%、99.71%、99.65%、99.70%、99.85%、99.61%、99.78%和99.89%，表明擴增序列為目標序列（圖1）。

圖2 唑啉草酯對抗藥性和敏感日本看麥娘種群GSTs相對活性的影響

Figure 2 Effects of pinoxaden on relative GSTs activities of the resistant and susceptible populations of

目標序列與大穗看麥娘對應序列分析結果表明，種群AH-28、AH-29和JS-15第1781位堿基由ATA突變為TTA，導致異亮氨酸突變為亮氨酸；種群AH-36和JS-16第2027位堿基由TGG突變為TGT，導致色氨酸突變為半胱氨酸；種群AH-34未發現突變（表4）。

2.3 唑啉草酯對日本看麥娘GSTs活性的影響

供試抗藥性種群經唑啉草酯藥劑處理后體內的GSTs活性迅速上升，均高于敏感種群AH-7。藥后5 ～ 7 d，抗藥性種群體內的GSTs活性上升至最大值，表明此時各種群體內對唑啉草酯的代謝反應水平最高；然后GSTs活性逐漸降低，分析可能是其對唑啉草酯代謝趨于完成。而敏感種群AH-7在活性下降期間伴隨著藥效癥狀的顯現，最終植株死亡，表明抗藥性種群體內GSTs對唑啉草酯具有更強的代謝能力（圖2）。

2.4 抗唑啉草酯日本看麥娘種群對其他除草劑的敏感性

測定結果顯示，相較于敏感種群AH-7，AH-29對ACCase抑制劑炔草酯、烯草酮，ALS抑制劑甲基二磺隆和氟唑磺隆產生了高水平抗性，抗性指數分別為45.32、29.54、37.53和23.04；并對三甲苯草酮、雙草醚和啶磺草胺產生了中水平或低水平抗性，抗性水平分別為6.47、3.10和4.08，但對PSII抑制劑異丙隆依舊敏感（1.86），仍可使用該藥劑對日本看麥娘進行防除（表5）。

表4 不同抗藥性日本看麥娘種群ACCase基因序列比較

種群各氨基酸的位置和堿基及相應氨基酸序列 2021202220232024202520262027202820292030 大穗看麥娘CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPhe AH-7CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPhe AH-36CTGTTCATACTTGCTAACTGTAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe JS-16CTGTTCATACTTGCTAACTGTAGAGGCTTC LeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe

注:下劃線表示該位點發生氨基酸突變。

表5 抗藥性日本看麥娘種群對8種除草劑的敏感性

3 討論與結論

日本看麥娘對唑啉草酯的抗藥性產生可能與其用藥歷史有關。有研究表明，ACCase類除草劑連續使用6 ～ 10年就能導致雜草對其產生抗藥性[23]。目前，國內已報道有多種雜草對該類除草劑產生了抗藥性，如看麥娘[24]、耿氏硬草[25]等，其所在地塊已連續多次使用ACCase抑制劑防除田間雜草，表明連續使用單一作用機制的除草劑是雜草抗藥性產生的重要原因之一。自2010年唑啉草酯在我國正式獲得登記后，其在田間的應用已超過10年，近年來，唑啉草酯對安徽、江蘇等小麥主產區日本看麥娘的防治效果逐漸下降，本研究所測的19個日本看麥娘種群中，已有9個種群對唑啉草酯產生了高水平抗性，這一事態應引起重視。

本研究中種群AH-28、AH-29和JS-15發生了Ile-1781-Leu的氨基酸突變形式，種群AH-36和JS-16發生了Trp-2027-Cys突變，該2種突變形式已在多種雜草中被發現，Yu等[26]報道Ile-1781-Leu突變是導致野燕麥對精噁唑禾草靈產生抗藥性的重要靶標分子機制。Délye等[27]在抗ACCase類除草劑的大穗看麥娘體內發現了Trp-2027- Cys突變。表明基因第1781與2027位突變同樣可能是導致上述日本看麥娘種群對唑啉草酯表現為抗藥性的重要原因之一。

代謝酶GSTs是能夠催化谷胱甘肽與其他化合物相連接從而使植物體達到脫毒的一組同工酶，其介導的代謝活性增強是造成雜草產生抗藥性的非靶標抗性機理方面的一種重要原因[15]。韓瑞娟等[28]報道，抗藥性日本看麥娘種群體內GSTs代謝反應水平經高效氟吡甲禾靈處理后明顯高于同處理敏感種群。本研究中，各抗藥性種群經唑啉草酯藥劑處理后體內的GSTs活性迅速上升，均高于敏感種群AH-7，其中，種群AH-34靶標位點并未發現突變，但抗藥性水平達AH-7的23.16倍，表明抗藥性與敏感種群之間GSTs對唑啉草酯解毒能力的差異也可能是導致其表現為抗藥性的原因之一。然而本研究僅對抗藥性與敏感種群體內的GSTs活性進行了測定與比較，對于非靶標抗性方面的研究還需進一步深入，如P450氧化酶活性的影響等。

據報道，通常雜草體內基因第1999、2027、2041和第2096位氨基酸發生突變僅會導致其對ACCase類除草劑中的APP類抑制劑產生抗藥性，而第1781、2078和第2088位氨基酸突變則會對不同的ACCase類抑制劑產生抗藥性[12, 29]。本研究中，基因發生Ile-1781-Leu突變的日本看麥娘種群AH-29對ACCase抑制劑炔草酯、烯草酮和三甲苯草酮均產生了高水平或中水平的交互抗性，其中炔草酯屬APP類抑制劑，烯草酮和三甲苯草酮屬CHD類抑制劑，此結果與前人研究一致。此外，AH-29對ALS抑制劑雙草醚、啶磺草胺、甲基二磺隆和氟唑磺隆也均產生了不同水平的抗藥性，其中對甲基二磺隆和氟唑磺隆表現高抗，但AH-29對PSII抑制劑異丙隆仍較敏感。此結果可為日本看麥娘等禾本科雜草的抗性治理，指導科學合理使用除草劑提供理論依據，并在農業生產實踐中結合深耕、輪作等農業措施，以延緩雜草抗藥性的進一步發展。

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Study on resistance mechanism ofto pinoxaden in wheat field

WAN Yongle1, DAI Lingling1, XING Yucheng2, SUN Qianqian1, XIANG Jing1, BI Yaling2

(1. College of Resource and Environment, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100; 2. College of Agriculture, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100)

In order to clarify the resistance level and possible resistance mechanism ofto pinoxaden in wheat field, the resistance level of 19populations in Anhui Province and Jiangsu Province to pinoxaden were determined by whole-plant bioassay. Thegene sequencing and GSTs activity determination were performed on the six populations with the highest resistance to compare the difference in gene sequences and GSTs activity between resistant and sensitive populations, and the sensitivity of AH-29 to other eight herbicides was also determined. The results showed that the ninepopulations had high level resistance to pinoxaden, accounting for 47.37% of the total tested population, and the resistance indices ranged from 12.70 to 38.77. Isoleucine (ATA) was mutated to leucine (TTA) at position 1781 ofgene CT region in AH-28, AH-29 and JS-15, and tryptophan (TGG) to cysteine (TGT) at position 2027 ofgene in AH-36 and JS-16. No mutation was found in population AH-34. The GSTs activity in six resistant populations was higher than that in susceptible population AH-7 after treated with pinoxaden. Population AH-29 showed high level of resistance to the acetyl-CoA carboxylase (ACCase) inhibitor clodinafop-propargyl, clethodim, and acetolactate synthase (ALS) inhibitor mesosulfuron-methyl and flucarbazone-sodium, withvalue of 45.32, 29.54, 37.53 and 23.04, respectively. In addition, AH-29 showed moderate resistance to tralkoxydim, low resistance to bispyribac-sodium and pyroxsulam, but it was sensitive to photosynthetic II (PSII) inhibitor isoproturon. The increases ofgene mutations and the GSTs activity were very likely the reasons resulting in pinoxaden resistance ofpopulations.

; pinoxaden; Jianghuai region; resistance; cross-resistance

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.023

2023-06-26 15:24:51

S481.4; S482.4

A

1672-352X (2023)03-0416-07

2022-07-29

國家發展改革委藏糧于地藏糧于技專項（發改投資[2021]430號），2022年度安徽省科技重大專項（202203a06020016）和農業農村部2022年農產品質量安全監管專項（農藥）（15227023）共同資助。

萬永樂，碩士研究生。E-mail：Wyl171@163.com

通信作者:畢亞玲，博士，教授。E-mail：byl-211@163.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1522.046.html