小立碗蘚PpCAD4基因敲除載體的構建及功能研究

田 旭，閆慧清，劉 露，謝 麗，成 亮，姜 山

小立碗蘚基因敲除載體的構建及功能研究

田 旭，閆慧清，劉 露，謝 麗，成 亮，姜 山*

(貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550025)

木質素是植物抵御外界環境的重要成分，肉桂醇脫氫酶（cinnamic alcohol dehydrogenase，CAD）是木質素合成途徑中的關鍵酶和限速酶之一。前期數據表明，在灰霉菌侵染下，基因上調表達，但功能尚未明確。本次研究利用同源重組原理構建-PTN182-敲除載體，從而破壞PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）結構域。利用PGE 6000介導小立碗蘚原生質體轉化，篩選并鑒定得到敲除突變體植株。qRT-PCR表明，敲除型植株中的表達量相對野生型減少了84%。通過對配子體的形態觀察發現，突變株通過增加配子體中擬葉的數量，使得植株生物量增加，這表明在早期陸生植物的生長發育中起著重要作用。用灰霉菌侵染小立碗蘚發現，0.5 d后野生型配子體菌絲入侵率為15%，菌絲入侵率為40%。侵染1 d后，配子體菌絲侵入率是野生型的2倍。表明能夠增加小立碗蘚對真菌病原菌的抗性。

木質素；肉桂醇脫氫酶；小立碗蘚；；基因敲除；灰霉菌

木質素(Lignin)是一種復雜的酚類聚合物，是植物細胞壁的重要組成，是植物體中僅次于纖維素的一種重要大分子有機物質[1]。木質素的出現被認為在植物從水生環境過渡到陸地生活中起著重要的進化適應性作用，賦予早期維管束植物物理支撐，使其直立，并通過疏導組織實現水和溶質的長距離運輸[2-3]。同時，木質素還可抵御生物病原菌入侵[4]。非維管束植物小立碗蘚（）屬于葫蘆蘚目（Funariales）葫蘆蘚科（Funariaceae），是高等植物中低等類群，是植物從水生向陸生過渡類群[5]。早期研究者認為小立碗蘚不合成木質素，但是合成木酯素或類木質素[6]。小立碗蘚具有合成木質素的全套基因，且本實驗前期研究發現受病原菌脅迫時細胞壁會形成保守的乳突結構抵御入侵[7]。

肉桂醇脫氫酶（cinnamic alcohol dehydrogenase，CAD）是木質素合成途徑中關鍵酶之一，是木質素合成途徑的終反應，它催化合成木質素單體[8]。研究結果證實，CAD是含有鋅蛋白的二聚體酶類，主要包含ADH_N (PF08240)和ADH_zinc_N (PF00107)兩個保守結構域[9]。CAD幾乎存在于所有植物中，并由多個基因和基因家族編碼[10]。在擬南芥()中鑒別出9個同源物[11]，且基因的功能都不一致，僅生成G-木質素和生成S-木質素[12]。Xu等在小立碗蘚中鑒別出4個基因，命名為、、和[13]。

灰葡萄孢（）又名灰霉菌，是一類重要的植物病原真菌[14]。有研究表明，小立碗蘚被真菌病原菌感染后，組織會出現軟腐、配子體褐變、原生質體萎縮、葉綠體解體、細胞壁酚類物質增加等現象[15]。擬南芥感染灰霉菌后癥狀首先出現在受感染的器官上，表現為局部病變，隨后擴散至花、葉和果實，最終導致器官塌陷并從植物上脫落[16]。

本實驗室構建了敲除載體和過表達載體，將其轉化至小立碗蘚中進行觀察，發現敲除植株和過表達植株的配子體與野生型在形態上并沒有太大的差異[17]。轉錄組數據表明，在灰霉菌侵染下基因均出現上調表達，其中基因顯著上調[18]。對小立碗蘚基因與其他物種的基因進化分析發現：和親緣關系較近，和單獨分枝[19]。獨特的進化關系可能具有其他生理生化功能。本研究通過構建敲除載體獲得突變株，為今后研究基因在早期陸生植物小立碗蘚中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

所用材料小立碗蘚和載體構建的PTN182載體均由由首都師范大學提供何奕騉教授贈送；DH5α感受態細胞由本實驗室制備；灰霉菌c023菌株由華東師范大學許玲教授提供。DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性核酸內切酶Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、PremixTM、T4-DNA連接酶、氨芐青霉素（Amp）、2 000 bp DNA Marker和15 000 bp DNA Marker均購于TaKaRa。Plasmid Mini Kit I試劑盒購于OMEGA biotek，卡那霉素購于美國Sigma公司，培養大腸桿菌試劑購于英國OXOID公司。引物的合成和序列測定工作，均委托上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 構建PpCAD4敲除載體

1.2.1上、下游臂的獲取 在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上檢索基因登錄號（XM_024537924.1），下載基因全長，將的DNA序列3 900 bp分成上游臂（, 721 bp）和下游臂（, 757 bp）兩段分別設計引物。引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表1所示。以提取的小立碗蘚DNA為模板，分別使用上游臂和下游臂的引物進行PCR擴增獲取上下游臂目的片段。PCR反應體系為：正向引物和反向引物各1 μL，小立碗蘚總DNA 3 μL，PremixTM酶25 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，32個循環，72 ℃連接5 min，4 ℃保存50 min。將PCR擴增得到的上、下游片段用1 %的瓊脂糖回收目的片段后保存于﹣20 ℃冰箱。

表1 PpCAD4上、下游片段擴增的引物序列

注：表中劃橫線部分為所添加的酶切位點。

1.2.2PTN182載體構建 用限制性核酸內切酶（Ⅰ和Ⅰ）在37 ℃水浴鍋中酶切PTN182質粒25 min。將膠回收的上游臂片段和酶切后的PTN182質粒避光16 ℃連接過夜，將連接液轉化至大腸桿菌感受態細胞保存。提取PTN182-上游臂質粒，將含上游臂的PTN182質粒用限制性核酸內切酶（Ⅰ、Ⅰ）酶切，用于連接下游臂，方法同上游臂。構建好的-PTN182-質粒送往上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

1.3 PEG介導的原生質體轉化及篩選

1.3.1 小立碗蘚原生質體的制備 取培養15 d的小立碗蘚新鮮材料研磨至勻漿，均勻地鋪在有玻璃紙的BCDATG培養基上培養7 d。將研磨2次的原絲體為材料加入到1%的崩潰酶中，避光輕搖0.5 h制備原生質體。用8% D-甘露醇洗滌原生質體2次，離心。300 μL MMM溶液重懸沉淀。取10 μL原生質體溶液，計算原生質體濃度，用MMM溶液調整原生質體濃度至1.6×106個待用。

1.3.2 PEG介導外源基因的轉化和鑒定 以-PTN182-質粒為模板，用限制性核酸內切酶Ⅰ、Ⅰ酶切后膠回收，加入30 μL膠回收產物至原生質體溶液中，加入等體積的PEGT，45 ℃熱激5 min。室溫搖1 h, 1 500 r·min-1, 共3 min，收集原生質體沉淀。用8 mL 45℃預熱的PRM/T重懸沉淀，均勻地鋪在PRM/B培養基中，繼續培養2周。用25 μg·mL-1G418進行第1次篩選，50 μg·mL-1G418第2次篩選。最終對存活植株進行分子鑒定，引物序列如表2所示。

表2 PpCAD4敲除后分子鑒定的引物序列

表3 qRT-PCR特異性引物

1.4 敲除突變體和野生型的qRT-PCR分析

在預冷的研缽中加入1 mL Trizol試劑，再放入180 mg新鮮小立碗蘚，液氮研磨至粉末泛白。加入250 μL三氯甲烷后靜置4 min，13 000 r·min-1，5 min，4 ℃離心，收集上清，再在上清中加200 μL異丙醇，快速混勻后靜置5 min，13 000 r·min-1，8 min，4 ℃離心棄上清；加2 mL 75%的乙醇，12 000 r·min-1，5 min，4 ℃離心棄上清。洗滌RNA 2次，加20 μL無核酸水溶解RNA[16]。將獲得的RNA反轉錄成cDNA，保存于﹣20 ℃冰箱待用。以為內參基因引物，引物為基因引物，引物設計如表3所示。進行實時熒光定量PCR，條件為：95 ℃、5 s，55 ℃、15 s，共40個循環。相對表達量的計算用公式2-△△Ct法[20]。

1.5 灰霉菌侵染小立碗蘚

將培養10 d的灰霉菌用無菌水洗滌3次紗布過濾收集濾液，4 000 r·min-1，離心10 min。加入少量無菌水重懸孢子，取10 μL于血球計數板上計數。用POB培養基將灰霉菌孢子濃度稀釋為5×105spore·mL-1備用。將生長25 d的小立碗蘚轉移至有少量無菌水的蛭石中，均勻地噴灑灰霉菌孢子懸液，以POB培養基為對照，收集材料。用臺盼蘭對材料進行染色，制成裝片，于光學顯微鏡下計算菌絲侵入率。侵入菌絲率= 細胞中菌絲入侵的細胞數/100[21]。

2 結果與分析

2.1 PpCAD4基因敲除載體的構建

利用SMART在線工具分析，發現基因編碼425個氨基酸；第78個氨基酸和第212個氨基酸是保守結構域ADH_N，第254到第385個氨基酸是ADH_zinc_N。所敲除的基因破壞了基因保守結構域（圖1A）。

以小立碗蘚基因組DNA為模板（圖1B），通過PCR反應擴增和基因片段，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果(圖1C)顯示，除空白對照外，其余兩條PCR擴增的條帶低于1 000 bp，與上述基因片段一致。經雙酶切后將其連接在PTN182載體上，然后挑取單個菌落進行菌液PCR驗證。結果（圖1D）顯示，除空白對照外，其余PCR擴增的條帶與基因片段一致。用Ⅰ和Ⅰ進行酶切后（圖1E），除泳道1為PTN182載體外，泳道2為1條5 000 bp的載體片段和1條757 bp的基因片段，后經測序驗證得到-PTN182載體；再將PCR擴增得到的下游臂片段連接到-PTN182載體上，用Ⅰ和Ⅰ酶切后得到與載體一致的片段和與下游臂一致的片段（泳道3）。測序驗證確定-PTN182-載體構建成功。

2.2 原生質體的制備及敲除植株鑒定

在1%的崩潰酶下制備小立碗蘚原生質體，取10 μL于血球計數板下觀察。結果（圖2A）所示，完整的小立碗蘚原生質體呈圓形或近圓形。II基因在小立碗蘚植株中表現為G418抗性，轉化原生質體在含 G418培養基上進行兩次抗性篩選（圖2B）。設計引物Q1、Q2和Q3進行分子鑒定（圖2C），Q1正向引物設計在上游臂外圍，反向引物設計在替換基因II上該引物擴增片段約含1 040個堿基對；Q2正向引物設計在替換基因II上，反向引物設計在下游臂上該引物擴增片段約含527個堿基對；Q3正向引物設計在上游臂外圍，反向引物設計在下游臂外圍該引物在突變株中擴增片段約含4 300個堿基對。3對引物設計用于確定敲除植株。經過PCR驗證得到的結果(圖2D)表明，Q1和Q2 2對引物在泳道5擴增片段與引物Q1設計擴增1 040 bp一致，泳道6擴增片段與引物Q2設計擴增527 bp一致。表明II基因已替換掉的部分序列。Q3引物未擴增出與預期一致的片段。

A：PpCAD4結構預測；B：小立碗蘚基因組DNA提?。╨ane1和lane2是小立碗蘚基因組DNA）； C：PCR擴增PpCAD4的上游片段和下游片段（lane1是陰性對照；lane2是擴增PpCAD4.1片段；lane3是擴增PpCAD4.2片段）；D：PpCAD4.1-PTN182- PpCAD4.2菌液PCR驗證（lane1為陰性對照；lane2和lane3是PpCAD4.1菌液PCR；lane4和lane5是PpCAD4.2菌液PCR）；E：PpCAD4.1-PTN182- PpCAD4.2質粒酶切驗證（lane1是原始的PTN182質粒，lane2是Kpn Ⅰ和SaⅠ Ⅰ雙酶切的質粒，lane3是Sph Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切的質粒）；M：Marker =15 000 bp。

Figure 1 Electrophoretogram of the predictedstructure and the construction ofknockoutPTN182vector

A：原生質體形態（黑色箭頭表示完整的原生質體），Bar =10 μm；B：G418篩選植株， Bar = 3 mm；C：3條引物設計區域分布；D：敲除植株分子鑒定(lane1、lane2是Q1、Q2引物陰性對照，lane3和lane4野生型植株，lane5和lane6突變植株)；M：Marker 5 000 bp。

Figure 2 The screening and identification of knockoutgametocyte

A：野生型配子體和突變型配子體表型，Bar =1 mm；B：PpCAD4的轉錄水平表達量；C：野生型與突變型的生物量。

Figure 3 The observation of wild type and-knockout plants

2.3 野生型和PpCAD4型基因表達和形態觀察

挑取型單個配子體與WT型植株在解剖鏡下進行觀察，擬葉對稱排列，葉片呈卵形，排列疏松。擬葉相比于WT型片葉的數量更多，葉片排列更為緊密（圖3A）。檢測基因的表達量發現，小立碗蘚野生型的表達量是突變株的6.25倍，表明了該基因被破壞后降低了基因的表達量（圖3B）。統計2種株型的生物量，發現突變株的鮮重高于野生型（圖3C）。因此，可看出配子體的葉片數量增多，葉片分布更為緊湊，植株生物量增加。

2.4 灰霉菌侵染野生植株與突變植株

通過噴灑濃度為5×105spore·mL-1灰霉菌孢子懸液，在光學顯微鏡下觀察灰霉菌感染小立碗鮮野生型與突變型的變化。計算菌絲侵入率發現，隨著感染時間的增加，兩種株型植株的莖與葉上的菌斑逐漸增多，表現為紅褐色。但接種后的第2天，觀察到的整個配子體均被菌絲覆蓋，而野生型則沒有明顯菌絲存在(圖4A)；臺盼蘭可通過死細胞的細胞膜，使死細胞中DNA與菌絲呈藍色或黃褐色，通過統計視野內100個細胞的死亡數目來推算侵入菌絲率，得出細胞內菌絲入侵的數量隨著入侵的時間的延長而逐漸增加（圖4B），且敲除基因的突變株灰霉菌入侵的細胞數高于野生型。在接種灰霉菌4 h后菌絲開始入侵，接種0.5 d后中大量細胞被菌絲入侵，其侵染率高達40%；而野生型植株侵染率只有15%。接種灰霉菌1 d后，植株的莖和葉均出現褐化，野生型的葉片開始褐化。在接種1 d后發現大量細胞有菌絲入侵，植株菌絲率提高到60%以上。接種灰霉菌2 d后，2種植株無極顯著差異，直至第5天時，葉片與莖褐色化顯著，而且植株葉片幾乎完全褐色化。表明真菌侵染小立碗蘚的防衛反應主要發生在早期。

A：灰霉菌侵染小立碗鮮形態觀察， Bar =1 mm；B：野生型與突變型侵入菌絲率的比較。

Figure 4 Infected behavior ofon

3 討論與結論

小立碗蘚全基因組測序已經完成，具有較高的同源重組效率，其原生質體再生能力強，有利于進行基因重組實驗[22]。本次研究采取的是20% PEG 6000作為誘導劑進行轉化實驗；而且PTN182質粒含有Ⅱ基因在小立碗蘚中表現為G418抗性，因此可用不同濃度的G418篩選突變株[23]。此外，用于小立碗蘚基因轉化的方式主要有兩種：PEG介導的遺傳轉化和農桿菌介導的遺傳轉化。PEG是一種化學誘導劑，在高pH和鈣離子的環境下加入一定濃度的PEG有利于外源DNA分子攝入原生質體[22, 24]。而利用農桿菌介導的原生質體遺傳轉化其轉基因植株的獲得周期較長；出現假陽性的頻率比較高[25]。因此采用PEG介導小立碗蘚原生質體轉化進行實驗。

本研究中的引物Q3沒有擴增得到上游臂外圍到下游臂外圍基因的片段，其原因可能是下游臂是以某種方式插入到基因上而非進行了同源重組替換。但是下游臂以插入的方式替換掉了的部分基因同樣是可以破壞掉基因，致使基因不能夠正常轉錄，從而影響其蛋白質的表達[26]。因此，該突變植株同樣可以用于后續功能研究。

小立碗蘚敲除載體構建并成功轉入小立碗蘚中獲得突變植株為探索在小立碗蘚的生長發育及是否參與生物脅迫等研究建立基礎。通過觀察，突變株配子體的葉片數量相比于野生型更多，排列更為緊湊。其配子體的表型與野生型配子體有著較大的差異，推測破壞基因的表達可能會導致小立碗蘚葉片增加。前期研究表明，敲除基因后突變植株沒有變化，而基因獨特的進化關系可能與小立碗蘚的形態建成有關。

敲除基因后小立碗鮮對灰霉菌的敏感性增加，表現為更易感病。在灰霉菌感染前期，菌絲入侵細胞行為并不明顯，可能是這個時期的灰霉菌孢子還未萌發。研究表明，灰霉菌孢子需要經過4 h的預萌發階段[27]。在灰霉菌侵染小立碗鮮12 h后，突變株侵入菌絲顯著增加，推測基因調控植物細胞壁物質發生變化，在防衛反應的早期增強植物抗病。因此，通過構建敲除載體并成功獲得的突變植株為研究基因功能以及早期陸生植物的生長發育奠定了一定基礎。

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Construction ofgene knockout vector and function study ofin

TIAN Xu, YAN Huiqing, LIU Lu, XIE Li, CHENG Liang, JIANG Shan

(School of Life Science, Guizhou Normal University, Guiyang 550025)

Lignin is an important component of plants against the external environment. Cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD) is one of the key enzymes and rate-limiting enzymes in the pathway of lignin synthesis. The previous data showed that the expression ofinwas upregulated afterassault, however, the function ofremained obscure in. In this study, knockoutvector was constructed in terms of homologous recombination, which could disrupt the alcohol dehydrogenase GroES-like (ADH_N) and zinc-binding dehydrogenase (ADH_zinc_N) domains encoded by PpCAD4. Subsequently, themutant plant was obtained by protoplast transformation mediated by PGE 6000 and identified by PCR. Compared with wild-type (WT), qRT-PCR analysis indicated that the expression ofinmutant plant was reduced by 84%. Interestingly, the number of phyllids and plant biom ass inmutant plant were increased, suggesting thatplays an important role in the growth and development in the early terrestrial plants. The rate of infected hyphae was 15% in WT, whereas the rate was 40% in theplant at 0.5 dpi (days post inoculated). The rate of infected hyphae ofwas 2 times of WT at 1 dpi. The result indicated thatcan increase the resistance ofagainst.

lignin; cinnamyl-alcohol dehydrogenase;;; gene knockout;

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.024

2023-06-26 16:10:35

Q782

A

1672-352X (2023)03-0423-06

2022-04-27

國家自然科學基金(32060587, 32060611)和貴州省自然科學基金重點項目(ZK[2023]ZD026)共同資助。

田 旭，碩士研究生。E-mail：tianxu0825@126.com

通信作者:姜 山，教授。E-mail：kyosan200312@hotmail.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1534.048.html