蒙脫石負載溶磷菌聯合磷肥對茶園土壤磷的調控

丁 園，習 莉，龍 燕，熊曉暉

蒙脫石負載溶磷菌聯合磷肥對茶園土壤磷的調控

丁 園1,2，習 莉1,2，龍 燕1,2，熊曉暉3*

(1. 南昌航空大學環境與化學工程學院，南昌 330063；2. 重金屬污染物控制與資源化國家地方聯合工程研究中心，南昌 330063；3. 江西省農業技術推廣中心，南昌 330046)

我國南方土壤磷素低、單施磷肥效果差，采用以溶磷菌為基礎的調控手段能有效緩解上述問題。以廬山云霧茶園土壤為研究對象，探究溶磷菌（PSB）、磷肥（過磷酸鈣P1、鈣鎂磷肥P2）、負載材料（Mt@PSB）及其組配劑對土壤速效磷含量的調控效果與作用機制。結果表明：茶樹為喜酸植物，鈣鎂磷肥（P2）及其組配劑堿性強，不適于茶園土壤調控。溶磷菌（PSB）、磷肥（P1）、負載材料（Mt@PSB）及其組配劑（PSB+P1、Mt@PSB+P1）調控后，茶園土壤pH均處于適宜茶樹生長的范圍（4.5～6.5），處理后土壤速效磷含量和酸性磷酸酶活性均顯著高于對照，培養45 d后速效磷含量分別增加21%、30%、18%、41%和63%，酸性磷酸酶活性分別增加14%、104%、10%、47%和107%。極差分析結果表明，上述3個因子對土壤磷的改善效果依次為Mt@PSB、PSB和P1，且Mt@PSB+P1的效果最佳。磷形態分析結果表明，PSB、Mt@PSB、P1主要通過將有機磷礦化為無機磷提高其有效性。PSB+P1和Mt@PSB+P1組配下，土壤速效磷含量的增加主要表現為Ca-P和Fe-P含量的增加。

茶園土壤；溶磷菌；速效磷；酸性磷酸酶；磷肥

土壤肥力是影響植物質量和產量的重要因素。據調查，江西土壤肥力總體水平較好，有機質含量較高，但土壤整體偏酸，速效磷含量普遍偏低[1]。磷肥能有效改善土壤缺磷情況[2]，但磷施入土壤后，易于被土壤中鐵/亞鐵離子、鈣離子、鋁離子等固定，生成難溶性磷酸鹽，導致吸收率降低[3]。

江西是產茶大省，地處江西境內的廬山云霧茶更是久負盛名。項目組前期研究表明，廬山茶園土壤速效磷含量在1.14～2.33 mg?kg-1之間，土壤肥力均低于高產優質茶園指標[4]。長期施入過磷酸鈣、鈣鎂磷肥等磷肥后，土壤全磷含量可保持較高水平，但實際磷肥利用率只有10%～25%左右[5]，大量磷元素被土壤固定，造成資源浪費以及一系列環境問題，合理施肥成為亟待解決的問題[6]。

提高土壤可利用磷含量是解決土壤供磷問題的主要手段。研究表明，土壤中的溶磷菌在生長代謝過程中分泌出有機酸，與土壤中鐵、鋁等離子形成螯合物釋放磷酸根，提高土壤速效磷含量[7]；溶磷菌還能通過分泌磷酸酶礦化有機磷提高土壤磷素的利用[8]。一般認為通過酸化、螯合、交換和聚合反應等途徑可將難溶性磷轉化為可溶性磷，提高土壤中難溶性磷酸鹽的溶解性[9-10]。Cinthia等[11]在花生、玉米等作物上接種內生溶磷菌，發現溶磷菌能夠促進作物生長并且提高根際土壤溶磷能力，磷的可利用性顯著提高?？梢娫谑┯昧追实耐瑫r合理配施溶磷菌有助于提高土壤磷的生物有效性。另一方面，增加溶磷菌與磷的有效接觸，可進一步提高磷的生物有效性。Su等[12]研究表明，溶磷菌和粘土礦物（蒙脫石）的相互作用在磷的長期轉運方面具有正調節作用。故在土壤中施入溶磷菌時，可以蒙脫石為載體，為其提供穩定的生長場所，促進土壤中磷的轉化，有望提高土壤速效磷含量，解決茶園土壤甚至南方土壤缺磷的普遍問題。

本研究從高海拔的廬山云霧茶園土壤中分離篩選土著溶磷菌（PSB），調節溶磷菌、蒙脫石和磷肥的組配方式，通過測定土壤pH、速效磷含量和酸性磷酸酶活性等指標的變化篩選合適的組配方案，并根據土壤磷形態轉化情況探討土壤速效磷含量變化的機理，以期為茶園土壤磷的高效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自江西省九江市廬山海拔1 100 m左右的某云霧茶場，土壤類型為黃棕壤，采集的土樣先去除雜質，然后風干過篩，充分混勻后裝袋備測。供試土壤基本理化性質如表1。

表1 供試土壤的基本理化性質

圖1 溶磷菌的系統發育樹

Figure 1 Phylogenetic tree of phosphate-solubilizing bacteria（PSB）

1.2 供試材料

供試磷肥：過磷酸鈣（Ca(H2PO4)2?CaSO4?H2O），標記為P1。購自國藥集團化學試劑有限公司，其中速效磷含量（以P2O5計）14.0%～15.0%；pH：1.5～3.0。

鈣鎂磷肥，主要成分包括Ca3(PO4)2、CaSiO3、MgSiO3，標記為P2。購自江陰忠農農資有限公司，其中速效磷含量（以P2O5計）12.0%～18.0%；pH為8～10。

溶磷菌（標記為PSB）：難溶無機磷培養基[13]分離土壤溶磷菌，平板劃線法純化，LB培養基擴增備用。PSB經16S rDNA測序獲得1 494 bp的基因片段，利用BLAST將菌株的基因序列與GenBank數據庫的基因序列進行相似性比較，結果表明溶磷菌與葡萄球菌屬同源性很高，與相似性達到100%。

選取19株同源性較高的葡萄球菌菌株序列與待測菌株序列構建系統發育樹，如圖1所示。從系統發育樹可以看出，溶磷菌與subsp. urealyticus strain CK27 相似度最高，去除首尾多余序列后同源性為100%。

蒙脫石負載溶磷菌（標記為Mt@PSB）：實驗采用載體結合法固定微生物[14]。將3 g蒙脫石置于PSB懸濁液中，固定18 h后取出，生理鹽水洗滌至中性，離心，所得固體即為蒙脫石負載溶磷菌。用場發射掃描電鏡（日立公司SU1510型，日本）分析上述材料的表面形貌特征，如圖2所示。結果表明，樣品表面整體呈現薄厚不一的團狀或絮狀，少部分區域呈規則的晶型結構，說明晶型結構的蒙脫石表面有物質附著，證實溶磷菌負載成功。

圖2 蒙脫石@溶磷菌的掃描電鏡（SEM）圖片

Figure 2 Scanning electron microscopy (SEM) images of montmorillonite supported PSB

表2 土培實驗方案

1.3 方案設計

為研究溶磷菌、磷肥、負載材料及其組配措施對土壤有效磷的調控效果，設計了不同的實驗方案（表2）。

土壤滅菌后，按表2開展土壤培養實驗，培養周期為45 d，培養溫度為25℃，每間隔15 d 取樣一次，每個處理設置3個重復。每個處理的土壤重量為100 g（無菌土），土壤水分保持田間持水量的70 %左右。

1.4 測定項目及方法

土壤pH采用pH計測定（水∶土=2.5∶1）；速效磷采用NH4F-HCl浸提比色法測定；酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定；土壤磷形態分析：采用酸性土壤無機磷形態的分級測定：可交換態磷（Ex-P）、鋁結合態磷（Al-P）、鐵結合態磷（Fe-P）、閉蓄態磷（Oc-P）、鈣結合態磷（Ca-P）；有機磷（Or-P）采用硫酸與氫氧化鈉浸提法測定，具體檢測方法參照《土壤農化分析》[15]。

1.5 數據處理

采用SPSS 26統計軟件進行顯著性分析（<0.05），并采用Origin 2018進行作圖，極差分析用于分析影響土壤速效磷含量的主要因素。

2 結果與分析

2.1 蒙脫石@溶磷菌聯合磷肥對茶園土壤pH影響

如圖3所示，施用溶磷菌、磷肥、負載材料及其組配劑15 d后，各處理土壤的pH值已經與對照土壤表現出明顯差異，隨后30 d、45 d的變化趨勢也基本一致。如材料與方法所述，P2堿性較強（8～10），所以P2及其組配的PSB+P2、Mt@PSB+P2處理，土壤pH升至6.33～6.89，已不適合茶樹生長[4]，故后續不再分析含P2及其組配劑的處理效果。

圖中不同字母表示同一時間的不同處理在0.05水平上差異顯著。

Figure 3 Change of tea garden soil pH under different treatments

單施PSB、P1和Mt@PSB處理對土壤pH的影響差異較大。PSB施入土壤初期（0～30 d），溶磷菌在菌群中占主導地位，分泌出大量有機酸，顯著降低土壤pH。45 d時，微生物群落趨于平衡后土壤pH回調，對比CK，差異不顯著。洪堅平等[16]向小麥根際土壤添加大腸桿菌與毛霉的實驗結果也表明微生物對土壤pH的影響有限。P1呈酸性，施用后土壤pH降至5.47～5.55（0～45 d），與對照相比，差異顯著。制備的Mt@PSB呈中性，可能抑制土壤pH降低[17]，因此施用后土壤pH提高反升至5.72～6.21（0～45 d）。趙玉連等[18]也報道，土壤菌-蒙脫石體系的pH高于單施土壤菌。單施上述調理劑后土壤pH處于5.31～6.21范圍，均滿足茶樹正常生長的需求（0～45 d）[4]。

PSB+P1對土壤具有雙重酸化作用，0～45 d內，土壤pH較低（5.11～5.44），但仍適合茶樹生長。Mt@PSB+P1處理的土壤pH顯著低于Mt@PSB處理，但與PSB處理差異不顯著，且在第45天時與對照無顯著差異。說明，Mt@PSB+P1處理對土壤pH的擾動較小。

2.2 蒙脫石@溶磷菌聯合磷肥對茶園土壤速效磷含量及酸性磷酸酶活性的影響

茶園土壤缺磷現象普遍，施肥初期磷肥易被吸附固定，后期逐漸轉化為化學固定，所以隨著時間的推移，磷肥更難被利用[19]。土壤速效磷含量及酸性磷酸酶活性是反應土壤磷含量和可利用性的有效指標。圖4為PSB、P1、Mt@PSB及其組配劑對茶園土壤磷的影響。從圖4（a）的統計學分析結果可以看出，在0～45 d的培養期內，Mt@PSB、PSB+P1和Mt@PSB+P1等3個處理隨著培養時間的延長，速效磷含量和酸性磷酸酶活性顯著增加，CK、PSB和P1未表現出顯著差異。因此，進一步分析處理45 d后土壤速率磷含量和酸性磷酸酶活性相對對照土壤的增減情況，如圖4（b）所示。

（a）中不同字母表示同一處理的不同時間在0.05水平上差異顯著；（b）中不同字母表示同一時間的不同處理在0.05水平上差異顯著。

Figure 4 Change of the content of available phosphorus and the acid phosphatase activity in tea garden soil under different treatments

PSB、P1、Mt@PSB處理后（45 d），土壤速效磷含量提高至2.75～3.16 mg?kg-1，比對照土壤分別增加了21%、18%和30%，差異顯著（<0.05）。單一處理條件下，Mt@PSB的效果較好，可能是因為蒙脫石增加了溶磷菌與土壤磷的作用機率，促進溶磷菌生長代謝。

PSB+P1處理在0～30 d內速效磷含量與PSB、P1處理無明顯差異，后期顯著提高至3.42 mg?kg-1，與Mt@PSB處理的趨勢一致，相比CK、PSB和P1，PSB+P1處理45 d后，土壤速效磷含量分別提高了41%、20%和23%，見圖4（b）。Mt@PSB+P1組配劑施用后，速效磷含量進一步增加，分別提高了63%、42%和45%。故Mt@PSB+P1更有利于改善土壤缺磷情況。對標全國第二次土壤普查相關標準，PSB+P1和Mt@PSB+P1處理的土壤含磷等級由VI升至V級[20]。這主要是由于溶磷菌通過酸解、酶解等作用將有機磷、無機磷溶解為速效磷，因此提高土壤磷的利用效率[21]，且以蒙脫石為載體，可增強溶磷菌在土壤中的定殖能力，提高溶磷效果，進一步增大PSB對土壤磷活性的影響。Tanuwidjaja等[22]實驗也得到相似的結論：蒙脫石的特性能夠穩定更多的外部磷源，其與溶磷菌的相互作用，驅動磷在土壤中轉化。

0表示不含處理因子，如PSB0表示不含溶磷菌因子。

Figure 5 Range analysis and the effects of different factors on soil phosphorus activity in tea garden within 45 days

酸性磷酸酶參與有機磷向速效磷的轉化，對調控土壤磷素的有效性具有重要意義[23]。圖4結果表明，酸性磷酸酶的變化趨勢與速效磷大體一致。單一處理條件下，Mt@PSB的處理效果較好，培養45 d后比CK、PSB和P1分別提高了104%、90%和94%，說明蒙脫石促進微生物生長代謝，提高磷酸酶活性[17]。但組配劑PSB+P1和Mt@PSB+P1的處理未顯著高于單一處理，其原因有待進一步分析。

2.3 不同組配措施對茶園土壤磷活性影響的極差分析

組配措施的效果受因子間交互作用的影響較大，為準確判斷單因子對土壤磷的影響，本研究采用極差分析法繪制45 d內PSB、P1和Mt@PSB因子的極差箱線圖，并對比PSB＋P1和Mt@PSB+P1處理的箱線圖結果，分析P1、PSB及Mt@PSB等因子對土壤速效磷含量及酸性磷酸酶活性的作用效果（如圖5）。

由圖5知，PSB、P1和Mt@PSB因子對速效磷含量產生的極差分別為0.49 mg?kg-1(2.64～3.14 mg?kg-1)、0.4 mg?kg-1(2.77～3.17 mg?kg-1)、0.46 mg?kg-1(2.82～3.27 mg?kg-1)；對酸性磷酸酶活性產生的極差分別為0.67 mg?g-1?d-1(1.45～2.12 mg?g-1?d-1)、0.17 mg?g-1?d-1(1.81～1.98 mg?g-1?d-1)、0.71 mg?g-1?d-1(1.66～2.37 mg?g-1?d-1)。其中Mt@PSB的極差最大，其次為PSB，最后是P1。PSB+P1和Mt@PSB+P1組配后土壤磷的可利用率均較高，且Mt@PSB+P1組配下土壤磷的可利用率提高幅度最大，其中土壤速效率磷和酸性磷酸酶活性分別提高至3.65 mg?kg-1（CK:2.46 mg?kg-1）和2.34 mg?g-1?d-1（CK:1.27 mg?g-1?d-1）。

圖6 不同處理條件下土壤磷形態轉化規律

Figure 6 Transformations of soil phosphorus fractions under different treatments

2.4 溶磷菌、蒙脫石和磷肥對土壤中磷素形態轉化的影響

磷素有效性與磷素形態轉化規律息息相關，了解磷形態轉化規律有利于提高土壤磷素利用率[24]。一般認為，Ex-P即水溶態磷，易隨著環境變化解吸，有效性最高[25]，Ca-P、Al-P、Fe-P屬于礦物磷，有效部分含量高低順序為Ca-P>Al-P>Fe-P[24,26]，不同處理條件下土壤磷形態轉移規律如圖6所示。

PSB施入土壤后，酸性磷酸酶活性提高，促進有機磷（Or-P）礦化為無機磷，如轉化為易被土壤中鐵離子吸附固定的Fe-P[27]，Mt@PSB處理的變化趨勢與PSB處理一致。P1施入土壤后，土壤Fe-P含量顯著增加，且Or-P含量降低，可能是由于南方土壤中鐵含量較高驅動Fe-P的形成。故土壤單施PSB、Mt@PSB、P1時，促進了Or-P的降低和Fe-P的增加。

PSB+P1和Mt@PSB+P1處理下，與單施P1處理相比較，Fe-P含量活性降低，但活性更高的Ca-P含量增加，分別提高8.68 mg?kg-1和9.58 mg?kg-1，且Mt@PSB+P1措施的無機磷總量更高（與對照相比，增加了23.5%）。進一步分析Mt@PSB+P1處理下土壤P各形態的結果，Ex-P、Ca-P、Al-P、Fe-P含量分別相比對照提升28%、46%、45%和 21%，提高土壤磷的有效性。結合對照土壤磷各形態的含量知，無機磷含量的增加主要表現為Ca-P和Fe-P的增加。

3 結論

溶磷菌（PSB）、磷肥（P1）、負載材料（Mt@PSB）及其組配劑調控后，茶園土壤pH均處于適宜茶樹生長的范圍（4.5～6.5），這主要是由于上述材料的pH為弱酸至近中性。

溶磷菌（PSB）、磷肥（P1）、負載材料（Mt@PSB）及其組配劑（PSB+P1、Mt@PSB+P1）均能提高土壤速效磷和酸性磷酸酶活性，與對照相比差異顯著。培養45 d后速效磷含量分別增加21%、30%、18%、41%和63%，酸性磷酸酶活性分別增加14%、104%、10%、47%和107%。極差分析結果表明，上述3個因子對土壤磷活性的改善效果依次為Mt@PSB、PSB和P1，且Mt@PSB+P1的效果最佳。

PSB、Mt@PSB、P1主要通過將有機磷礦化為無機磷提高其有效性。PSB+P1和Mt@PSB+P1組配下，土壤速效磷含量的增加主要表現為Ca-P和Fe-P含量的增加。

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Regulation of phosphorus in tea garden soil with montmorillonite supported phosphate-solubilizing bacteria combined with phosphate fertilizer

DING Yuan1,2, XI Li1,2, LONG Yan1,2, XIONG Xiaohui3

(1. Department of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang Hangkong University, Nanchang 330063; 2. National-Local Joint Engineering Research Center of Heavy Metal Pollutant Control and Resource Utilization, Nanchang 330063;3. Jiangxi Agricultural Technology Extension Center, Nanchang 330046)

Low phosphorus content and inefficient phosphorus fertilizer are the soil problems in the southern China. The control methods based on phosphate-solubilizing bacteria (PSB) will effectively alleviate these problems. Taken Lushan tea garden soil as test sample to explore the regulation effects and mechanism of PSB, phosphate fertilizer (superphosphate P1, calcium magnesium phosphate P2), supported materials (Mt@PSB) and their combinations on soil available phosphorus (AP) content. The results showed that P2 was not suitable for tea garden, because P2 and its compounds were alkaline, but tea plants were acidophilic plants. After the application of PSB, P1, Mt@PSB and their combinations (PSB+P1、Mt@PSB+P1), the soil pH of tea garden was just in the suitable range for tea tree growth (4.5-6.5). The content of AP and acid phosphatase activity of soil after the treatments were significantly higher than control. After 45 days’ incubation, the content of AP increased by 21%, 30%, 18%, 41% and 63%, respectively, the acid phosphatase activity increased by 14%, 104%, 10%, 47% and 107%, respectively. The range analysis results showed that the improvement effects of the three factors on soil AP were Mt@PSB, PSB and P1 in turn, and Mt@PSB+P1 performed the best. The result of phosphorus fractions analysis showed that PSB, Mt@PSB and P1 improved the content of AP mainly by mineralizing organic phosphorus into inorganic phosphorus. Under the regulation of PSB+P1 and Mt@PSB+P1, the increase of AP content was mainly reflected by the increase of Ca-P and Fe-P content.

tea garden soil; phosphate-solubilizing bacteria; available phosphorus; acid phosphatase; phosphate fertilizer

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.022

2023-06-29 16:05:11

S571.106.1

A

1672-352X (2023)03-0484-06

2022-06-29

國家自然科學基金（41967021）和南昌航空大學重金屬污染物控制與資源化國家地方聯合工程研究中心開放基金 (EL202280080)共同資助。

丁 園，博士，副教授。E-mail：39011@nchu.edu.cn

通信作者:熊曉暉，高級農藝師。E-mail：583132636@qq.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230628.1737.002.html