EGFR酪氨酸激酶及其抑制劑的研究進展

關 靜, 朱美靈, 夏德斌

(1.哈爾濱醫科大學 藥學院, 哈爾濱 150081; 2.哈爾濱工業大學 化工與化學學院, 哈爾濱 150001)

0 引 言

EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產物,是人表皮生長因子受體(Human epidermal growth factor receptor, HER)家族成員之一。研究發現,EGFR分為三區:胞外配體結合區、跨膜區和胞內激酶區,廣泛分布于各種上皮細胞的細胞膜上。EGFR基因位于第七號染色體上,由118個堿基組成,包括28個外顯子。其轉錄形成的mRNA長約5.6 kb,編碼的EGFR是分子量為170 kD的跨膜糖蛋白。編碼蛋白由1 186個氨基酸組成,具有氨基酸激酶(Tyrosine kinase, TK)活性,可以將胞內信號傳遞到胞外[1]。已報道的EGFR配體有表皮生長因子EGF、結合肝素的EGF、轉化生長因子TGF、β-細胞素和雙調蛋白等[2]。EGFR信號通路過度活化和EGFR自身過度表達是惡性腫瘤的主要發生機制[3-4]。EGFR相關信號通路主要有RAS/MAPK、NF-KB、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT等[5]。與配體結合后,EGFR由單體轉化為二聚體,然后激活它位于細胞內的激酶通路,包括Y992、Y1045和Y1148等激活位點,使下游磷酸化,誘導細胞增殖,腫瘤生長。而在實體腫瘤中EGFR高表達或異常表達,研究表明,EGFR基因突變和蛋白的過度表達都可以激活下游信號通路[6],這與癌癥密切相關。

主要的EGFR靶向藥物可以分為兩大類:一類是單克隆抗體(簡稱單抗),作用于胞外區,競爭性地抑制配體與EGFR的結合,從而阻斷EGFR酪氨酸激酶的活化;另一類是小分子酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors, TKIs),它進入細胞內,干擾三磷酸腺苷(Adenosine-triphosphate, ATP)結合,抑制21 bp氨基酸激酶磷酸化。雖然EGFR靶向治療已成功應用于臨床并取得了一定的療效,但治療過程中患者出現的耐藥現象(包括原發性耐藥和獲得性耐藥兩種)仍是一個亟待攻克的難題。發展和創新EGFR抑制劑是一個重要的研究目標,本文對TKIs代表藥物進行綜述。

1 EGFR-TKIs的研發進展

惡性腫瘤是一類嚴重危害人類健康的疾病,研究和開發高效、選擇性強的低毒抗腫瘤藥物是藥學工作者的目標之一。肺癌是世界上最常見的癌癥,每年都有超過100萬人死于肺癌,而80%～90%患者為非小細胞肺癌(Non small-cell lung cancer, NSCLC)[7]。在非小細胞肺癌中,EGFR突變大約占12%～47%,其中最為常見的兩種突變是19號外顯子的缺失突變(del19)和21號外顯子的點突變(主要是L858R)[8]。EGFR是癌癥生長的刺激因素,與腫瘤的發生有密切關系,EGFR-TKIs成為抗腫瘤藥物研發的重要方向。

吉非替尼(Gefitinib, ZD1839)和厄洛替尼(Erlotinib, OSI774)是第一批用于治療非小細胞肺癌的EGFR-TKIs,并取得一定療效,兩者對野生型EGFR有效,對L858R和delE746-A750有敏感性[9]。Gefitinib是一種口服型、苯胺喹唑啉類可逆性酪氨酸激酶抑制劑。吉非替尼在聯合化療中取得明顯效果,它在與順鉑、卡鉑、奧沙利鉑和紫杉醇等細胞毒性藥物聯合用藥時能增強抑制作用,促進腫瘤細胞凋亡[10]。厄洛替尼(Eelotiinib, OSI774)是第一個獲得美國食品公司藥品管理局批準的一類口服型EGFR-TKIs藥物,與化療類藥物聯合使用可以獲得更好的治療效果和生存期,改善患者生存質量[11]。然而,患者對這些抑制劑在9～13個月后產生獲得性耐藥。常見的與耐藥相關的EGFR突變有19號外顯子缺失、L858R突變和T790M突變,而大約50%～60%的耐藥是由于EGFR T790M突變[12]。另外,?？颂婺?Icotinib, BPI-2009)于2011年6月7日獲中國食品藥品監督管理總局批準上市,打破了非小細胞肺癌,特別是晚期非小細胞肺癌治療由進口藥品壟斷的格局。?？颂婺釋ν砥贜SCLC的療效與吉非替尼相當,安全性較吉非替尼更優,中位無進展生存期為4.6個月。TKIs靶向藥物對血腦屏障的穿透率分別為?？颂婺?6.1%,厄洛替尼2%～4%,吉非替尼1%,因此對于存在腦轉移和21號外顯子突變的患者,?？颂婺崾堑谝淮鶷KIs藥物中的首選用藥。

德國勃林格殷格翰公司研發的第二代EGFR-TKIs藥物阿法替尼(Afatinib, BIBW2992)是一種新型口服制劑,是EGFR/HER2雙重酪氨酸激酶受體的不可逆抑制劑。它與具有催化作用的EGFR第773位酪氨酸結合,以非ATP競爭方式使受體蛋白不可逆改變,對EGFR野生型和突變型包括T790M都有很好的抑制作用[12]。阿法替尼與T790M突變的結合能力是第一代TKIs的100倍以上。阿法替尼與西妥昔單抗聯合治療可有效抑制T790M耐藥突變的NSCLC原代細胞[14]。針對EGFR激活突變的患者,通過阿法替尼和順鉑分別聯用培美曲塞的對比,可觀察到阿法替尼與培美曲塞聯用對T790M突變的NSCLC存在明顯的協同生長抑制作用,尤其是對T790M突變可逆性EGTR-TKIs耐藥患者[15]。但是阿法替尼對野生型EGFR和突變型EGFRs有相同的結合力,缺失了對野生型EGFR的選擇性,導致產生毒性和較嚴重的副作用[16]。達克替尼(Dacomitinib, PF299804)是美國輝瑞公司研制的第二代、不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑,該藥作用機制類似阿法替尼,能不可逆抑制三種不同ERBB家族分子成員,包括EGFR(HER1)、HER2和HER4。達克替尼用于攜帶EGFR激活突變的局部晚期或轉移性NSCLC患者的一線治療,死亡或疾病進展風險顯著降低了41%,中位無進展生存期為14.7個月,總緩解率為75%,中位緩解持續時間為14.8個月[17]。

通常在服用一代或二代EGFR抑制劑后9.2～14.7個月時,患者會出現不同程度的耐藥性。在這些耐藥突變中,約有50%～70%發生在EGFR上門控位置(Gatekeeper)T790M。該突變可引起EGFR空間構像改變,增加EGFR對ATP的親和力,從而削弱抑制劑與EGFR的結合能力。二代EGFR抑制劑阿法替尼雖然在體外對EGFR-T790M突變有抑制活性,但在臨床應用中仍然未能克服T790M突變產生的耐藥性。且一代和二代EGFR抑制劑都很難排除對野生型EGFR的抑制,從而導致明顯的皮膚毒性(如痤瘡樣皮疹)。直到第三代抑制劑奧西替尼出現,這種情況才得以解決,如圖1所示。奧西替尼(Osimertinib, AZD9219)和奧母替尼(Olmutinib, HM61713)是針對T790M突變的第三代EGFR-TKIs,對EGFR敏感突變和T790M耐藥突變有更好的療效。奧西替尼為單苯胺基嘧啶環化合物,通過與EGFR激酶區ATP結合域的半胱氨基-797殘基不可逆共價結合來抑制EGFR活性[18]。將奧西替尼單藥用于一線和二線治療,療效良好,具有安全性和可耐受性。Janne等對局部進展或轉移的EGFR-TKIs耐藥患者的治療效果、不良反應藥效量、有效性及安全性進行了評估[19-21]。而對于聯合治療,體外研究結果顯示,如果奧西替尼與 MEK阻滯劑司美替尼和曲美替尼聯合使用能有效延遲耐藥細胞的生長,意味著奧西替尼與其他抗腫瘤藥物聯用也許可延緩奧西替尼耐藥的發生[22-23]。奧母替尼也是針對T790M突變的第三代EGFR-TKIs,在2016年于韓國批準上市,用于既往接受過TKIs治療的局部晚期或轉移性EGFRT790M突變NSCLC患者。然而治療病人很高概率發生了第三代的C797S突變,其他突變還有:EGFR L718Q突變、L718Q.L844V和C797S突變,HER2和MET擴增等,使第三代EGFR-TKIs出現了耐藥抵抗[24]。EGFR 與 VEGFR均可通過激活下游信號通路PI3K/AKT和Ras/Raf/Erk影響細胞生理功能。在EGFR突變的NSCLC中,上調的 EGFR 突變通過不依賴缺氧的機制增加VEGF,進而促進了對EGFR-TKIs耐藥的產生[25]。

圖1 EGFR突變及EGFR-TKIs代表藥物

EAI045是第一個針對T790M和C797sEGFR突變的變構非ATP競爭性抑制劑。研究者證明了EAI045能顯著提高二聚體缺陷的EGFR突變活性,其與西妥昔單抗聯合使用能顯著抑制具有L858R/T790M突變的Ba/F3細胞增殖。因為它的殘基遠離變構結合口袋,C797S突變不會影響EAI045的療效,但此變構抑制劑單獨使用無效,聯合使用西妥昔單抗可使EAI045抵制T790M和C797s活性充分提高。西妥昔單抗不是EGFR突變體特異性的單克隆抗體,可能導致靶向WT EGFR相關毒性,所以EAI045未能進入臨床試驗[26-27]。

2019年,丹娜-法伯癌癥研究院研發的JBJ-04-125-02在體外和體內均可抑制細胞增殖和EGFRL858R/T790M/C797S信號傳導,而且毒性比EAI045小很多,但JBJ-04-125-02對EGFRDel19/T790M/C797S突變無效。EGFR與其配體結合后,在細胞表面形成二聚體,細胞內自磷酸化后激活下游傳導通路。JBJ-04-125-02對EGFR二聚體含量高的腫瘤細胞株抑制能力弱,而西妥昔單抗能夠阻斷EGFR二聚體的形成,JBJ-04-125-02聯合西妥昔單抗增強了抗腫瘤活性。而且,奧希替尼同樣可以增強JBJ-04-125-02的抗腫瘤活性,且副作用比西妥昔單抗方案小。2019年底,該研究院對JBJ-04-125-02聯合奧希替尼開啟了一期臨床實驗[28]。

2019年10月,我國正大天晴藥業集團研發的四代EGFR靶向藥TQB3804正式步入I期臨床實驗。TQB3804不但可以解決奧西替尼的耐藥問題,而且能抑制1/2代TKIs耐藥后的T790M雙重突變,具體如表1所示。

表1 EGFR-TKIs代表藥物的基本信息

2019年11月,勃林格殷格翰制藥公司的科學家通過高通量篩選和基于結構的藥物設計研發了第四代EGFR抑制劑BI-4020。蛋白及細胞實驗均顯示,其能有效抑制T790M和/或C797S突變的EGFR,并在含順式三突變del19/T790M/C797S的小鼠異體移植NSCLC腫瘤模型(Human PC-9)上顯示很好的藥效[29]。

2020年1月,韓國的Bridge Biotherapeutics 公司宣布,美國食品和藥物管理局批準了BBT-176作為EGFR靶向的酪氨酸酶抑制劑治療非小細胞肺癌進入臨床實驗。

2 EGFR-TKIs與EGFR蛋白的相互作用關系

2.1 第一代EGFR-TKIs

EGFR分子的第790位殘基處在非常重要的位置,它位于蛋白結構的連接N和C-lobe的鉸鏈部分,并且處于ATP結合口袋深處, 可以使吉非替尼和厄洛替尼分子與蛋白充分靠近。因此,門控位置 (Gatekeeper)的殘基是一個激酶與小分子藥物結合的特異性的重要決定因素。吉非替尼和厄洛替尼具有4-苯胺喹唑啉的內核,晶體學結構提示,兩種藥物對于野生型或突變體激酶結合方式相似,通過與ATP競爭位于激酶區的ATP結合位點,抑制EGFR的酪氨酸激酶活性,如圖2和圖3所示。發生T790M突變后,蛋氨酸(Met)側鏈變長,導致了第一代EGFR-TKIs與ATP口袋結合的位阻性,阻斷與藥物的最佳相互作用,同時與ATP的親和力高于EGFR-TKIs,從而使ATP競爭抑制劑失效[30-32]。

圖2 吉非替尼的結構及其與EGFR蛋白激酶結構域的鍵合模式

圖3 厄洛替尼的結構及其與EGFR蛋白激酶結構域的鍵合模式

2.2 第二代EGFR-TKIs

阿法替尼的喹唑啉環是重要的結構單元,與ATP競爭細胞內的激酶結構域,從而阻礙下游信號的傳導。 喹唑啉母核上的N-1原子與激酶Met793上的NH形成分子間氫鍵。喹唑啉環C4位上的2-氯-3氟苯胺基與空間上方Val726和Met766的分子間作用力使阿法替尼進一步深入ATP結合位點。喹唑啉母核C6位上側鏈的烯丙酰結構對Afatinib發揮抗腫瘤活性作用至關重要,它與EGFR上半胱氨酸殘基Cys797的巰基發生邁克爾加成反應,可使激酶失活,不可逆地抑制酪氨酸激酶的活性,如圖4所示[33-34]。研發人員通過結構鑒定進一步證明了共價鍵的存在,并且發現阿法替尼通過與HER2的Cys805以及HER4的Cys803相互作用而抑制酶的活性[35]。

圖4 阿法替尼的結構及其與EGFR蛋白激酶結構域的鍵合模式

2.3 第三代EGFR-TKIs

奧西替尼和奧母替尼均具有一個“U”型結構,有利于與表皮因子受體目標結合。第三代EGFR-TKIs有丙烯酰胺的結構單元,它可以作為受體與在表皮因子受體ATP結合域內的Cys797的活性巰基發生邁克爾加成反應形成共價鍵,而帶有C797S突變的EGFR不能形成共價鍵。因為在生理條件下,絲氨酸的無活性巰基不能形成共價鍵,提供一個關鍵機制的阻力[9]。在晶體結構中,奧西替尼結合在P-loop和Pro794、Cys797之間的蛋白質骨架的ATP結合口袋外邊緣。有兩個氫鍵幫助錨定配體,即奧西替尼的N4氫原子與Met793的N原子;羰基氧原子與Cys797的N原子結合形成兩個氫鍵幫助固定配體。奧西替尼的取代苯環,與下面的蛋白質骨架發生范德華相互作用,與上面的非極性殘基廣泛作用,完成了夾心效果,Leu718與奧西替尼的苯環接觸,Ala743與嘧啶環接觸,Val726和Phe723與吲哚環接觸,Leu718-Gly719的蛋白質骨架也與吲哚環的邊緣形成范德華相互作用力,如圖5所示[36]。

圖5 奧西替尼的結構及其與EGFR蛋白激酶結構域的鍵合模式

同為第三代EGFR-TKIS的還有艾氟替尼(Alflutinib, AST2818),它是上海愛利斯特制藥有限公司開發的一種基于三氟乙氧基吡啶的不可逆EGFR-TKIs,對EGFR耐藥突變(如G719X、19號外顯子缺失、L858R、L861Q和T790M)具有較高的選擇性,對野生型EGFR無抑制作用。

2.4 第四代EGFR-TKIs

奧西替尼雖然解決了T790M突變的問題,但臨床上已經觀察到,進行奧西替尼二線治療的EGFRT790M陽性NSCLC患者,服藥10個月后出現耐藥現象,其中20%～40%為C797S突變(包含del19/T790M/C797S或L858R/T790M/C797S的順式或反式三突變)。因此,開發下一代EGFR抑制劑需要滿足更多臨床需求:一是對del19突變(最常見的突變形式)的EGFR具有高活性;二是能解決耐藥突變T790M和/或C797S;三是對野生型EGFR無作用;四是在整個人類激酶組顯示高選擇性。EAI045與EGFR作用呈“Y”形或“三葉螺旋槳”形,從EGFRT790M突變激酶的共晶結構可以看出,抑制劑EAI001與經典的ATP結合口袋附近的變構口袋結合,部分通過由內向外形成αC-螺旋結構,結合后作為一個“三葉螺旋槳”或“Y”形配置。氨噻唑片段延伸至T790M守門人蛋氨酸與Lys745殘基活性位點之間,視為T790M突變體的選擇性;苯基延伸到ATP結合口袋后面的疏水空隙,與Leu-777和Phe-856殘基相互作用,而第三個區域,1-氧異吲哚基沿αC-螺旋結構向溶液暴露區延伸。另外,EAI001氨基組在Asp-Phe-Gly(DFG)序列與Asp-855之間形成氫鍵。進一步藥物化學優化使苯基組產生了更大的影響力,也就是EAI045對野生型EGFR保持千倍的選擇性。然而EAI045的結合位點是EGFR激酶在不活躍的構象時由αC-螺旋運動產生的。兩個亞基的不對稱二聚體構成的異構結合位點不可接近,因此單獨使用EAI045的療效是有限的。當與西妥昔單抗聯合使用時,EAI045能成功到達每一種EGGFR激酶結構域[37-38],EAI045的噻唑、異吲哚啉-1-酮和對氟苯酚的芳香環,與EGFR激酶的多個疏水基團進行交互作用。具體來說,噻唑基團與Met790側鏈相互作用,對氟苯酚的苯基與Phe856側鏈相互作用,異吲哚啉-1-酮基團與Lle759、Leu747、Leu788、Leu777和Met766側鏈發生廣泛的疏水性相互作用,如圖6所示。極性在EAI045與EGFR激酶的相互作用中起到了重要作用?；衔锏孽０返优cEGFR的Asp855主鏈羧基形成氫鍵,異吲哚啉-1-酮的羰基氧與Lys745的側鏈ε-胺基形成另一個氫鍵[39-40]。

圖6 EAI045的結構及其與EGFR蛋白激酶結構域的鍵合模式

另外,吡啶并[3,4-d]嘧啶類化合物可以作為新的EGFR-TKIs[41-42]。吡啶并[3,4-d]的7位氮原子和6位的氨基吡啶氫原子,在鉸鏈區域與Met793形成了兩個氫鍵,支架2位的苯胺氫原子與看門人殘基Met790形成氫鍵,4位的氨基吡啶或氨基哌啶占據ATP核糖袋,并從Asp-Phe-Gly序列與Phe856和Asp產生范德華相互作用。位于吡啶并[3,4-d]嘧啶2位的苯胺插入背側疏水袋(BHP)產生疏水作用,這個疏水作用是必要的。4位的氨基哌啶上含有羥基,能使突變Ser797的氫鍵作用增強,能夠被設計成針對Ser797突變的小分子抑制劑。

JBJ-04-125-02的結構式如圖7(a)所示,它能夠與EGFR的變構袋結合,這種變構袋是由失活激酶構象中輪狀核c-螺旋向外位移產生的,如圖7(b)所示。噻唑酰胺、苯環和異吲哚啉酮的結合模式與之前觀察到的EAI001相似[40]。此外,在DFG基序中,羥基與Phe856的羰基形成氫鍵。4-哌嗪基苯基沿著環-螺旋延伸到溶劑暴露外表面,其苯環在激酶p-環上與Phe723發生π-π堆積。有趣的是,該化合物的結合誘導了激酶激活環的新構象,激活環中哌嗪和Glu865之間的氫鍵穩定了該構象,如圖7(c)所示。此外,Glu749定位在哌嗪基團的氫鍵上。預計與EAI045相比,重新配置的活化環和與哌嗪基團形成的氫鍵有助于增強該化合物的效力[28]。

圖7 (a) JBJ-04-125-02化學結構式; (b)與JBJ-04-125-02和AMP-PNP結合的 EGFRT790M/V948R晶體結構; (c)變構結合口袋

3 展 望

隨著醫療技術的不斷發展,人們對腫瘤的致病機制進一步了解,靶向治療成為研究熱點。不斷發展的靶向藥物能夠抑制酪氨酸激酶在細胞內的信號傳導,在腫瘤發生侵襲時發揮重要作用,針對EGFR-TKIs開發的一系列分子靶向抑制劑將會為腫瘤患者帶來希望。另外,隨著血液樣本中ctDNA檢測技術的快速發展,癌癥個體化深度測序分析方法(Cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)已經能夠準確測定非小細胞肺癌突變基因的分子分型,指導EGFR-TKIs靶向藥物的選用。未來基因檢測技術將適用于多種類型的惡性腫瘤并廣泛應用于臨床,相信會有更多療效精準的靶向藥物問世,促進個體化癌癥治療的發展,改善人類的健康狀態。