共同性外斜視貓的眼內直肌組織腦源性神經營養因子蛋白及mRNA表達觀察

孫一帆，李曉彤，張偉，郝瑞

1 天津醫科大學眼科臨床學院，天津 300020；2 天津市眼科醫院斜視與小兒眼科；3 天津市眼科學與視覺科學重點實驗室；4 南開大學附屬眼科醫院眼科

共同性斜視（concomitant strabismus）是指眼球運動無障礙，斜視角度不隨注視眼別和注視方向而改變的斜視。按偏斜的方向可將共同性斜視分為共同性內斜視和共同性外斜視［1］。共同性外斜視是臨床常見的斜視類型，發病率1%～3%，可影響患者的雙眼視功能發育，甚至破壞雙眼視功能［2］。目前共同性斜視的治療仍以手術為主，通過直肌手術來矯正患者眼位，但臨床治療效果不一［3］。共同性外斜視的確切病因和發病機制尚未完全闡明，可能與眼眶解剖結構、眼外肌的解剖異常、筋膜結構的異常、異常神經支配的集合和分開功能失衡等有關［4］。因此，了解眼外肌的病理變化，對于進一步認識共同性外斜視的發病機制以及指導臨床治療具有一定的意義。眼外肌是一種特殊類型的骨骼肌，具有組織重塑和持續自我更新的特點，能夠持續表達肌球蛋白重鏈的未成熟亞型、神經細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）等。研究［5］發現，兔、猴等成熟哺乳動物未受損的眼外肌組織中肌衛星細胞含量較高。肌肉損傷時肌衛星細胞可被激活，增殖、分化后形成成熟的肌肉纖維。腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是體內含量最多的神經營養因子，通過與酪氨酸激酶B結合，維持和促進神經元的發育分化與生長再生［6］。BDNF 是視神經損傷后哺乳動物視網膜中一種有效的神經節細胞的神經保護劑［7］。CLOW 等［8］研究發現，BDNF 參與調節衛星細胞功能和肌肉損傷后的肌纖維再生。目前，關于BDNF 在共同性外斜視中作用機制相關研究較少。2022年6—8月，我們觀察了共同性外斜視貓內直肌組織中BNDF 蛋白及mRNA 的表達變化，探討BDNF 在共同性外斜視發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物培養、分組及共同性外斜視模型構建方法 3～4 周齡雌性貓28 只，體質量280～325 g。貓在12 h 光/暗周期、相對濕度（40%～70%）、溫度（18～22℃）和噪音（＜50 分貝）的條件下自由獲取食物和水。28只貓隨機分為A、B、C 組及對照組，每組各7只。本實驗經天津醫科大學醫學倫理學專業委員會批準，符合相關動物指南。A、B、C 組貓均佩戴雙眼各15△底向外、尖向內三棱鏡2、4、6 個月，構建共同性外斜視模型。對照組貓全天配戴平光鏡片6個月。佩戴6 個月時，采用角膜映光法聯合三棱鏡檢查，三組貓眼睛棱鏡度＞10△，說明共同性外斜視模型造模成功，最終A 組6 只貓、B 組5 只貓、C 組5只貓造模成功。造模成功后取四組貓，經腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg，Sigma， CA， USA）麻醉后，用生理鹽水沖洗雙眼結膜囊，切開鼻側結膜囊，鉤取分離眼內直肌，留取眼內直肌組織。

1.2 各組貓眼內直肌纖維橫截面積及肌衛星細胞數測算 采用Masson 染色法。 取各組貓眼內直肌組織，4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脫水包埋，3～5 μm 的厚度連續切片，75%乙醇固定30 min，80%乙醇Ⅰ固定 30 min，80%乙醇Ⅱ固定 30 min，95%乙醇Ⅰ 固定150 min，95%乙醇Ⅱ固定 50 min，100%乙醇Ⅰ固定 60 min，100%乙醇Ⅱ固定 60 min，松節油Ⅰ固定 30 min，松節油Ⅱ固定 30 min，石蠟Ⅰ處理30 min，石蠟Ⅱ處理 30 min，石蠟Ⅲ處理30 min，組織切片用二甲苯15 min，無水乙醇處理5 min（2次），蒸餾水沖洗5 min（共2 次）。細胞核蘇木精染色5 min，蒸餾水洗滌5 min（2 次），5 g/L 鹽酸酒精誘導分化15 min。切片用麗春紅品紅溶液染色10 min，蒸餾水清洗5min（2 次），10 g/L 磷酸鋁染色2 min。苯胺藍或亮綠液處理5 min，再用0.2%冰醋酸水溶液浸泡。切片經95%酒精、無水酒精和二甲苯處理后用中性樹膠封住，在BX51 光學顯微鏡（Olympus，Japan）下觀察各組貓內直肌組織病理變化，測算內直肌纖維橫截面積及肌衛星細胞數。重復測算3次，取平均值。

1.3 各組貓眼內直肌肌肉組織BDNF mRNA 檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法。取四組貓眼內直肌組織，收集內直肌總RNA，逆轉錄合成cDNA。反應體系為：熒光定量PCR 預混液10 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，擴增條件為：98 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，變性-退火-延伸共循環40 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，Ct=實驗組（Ct 靶基因-Ct GAPDH）-對照組（Ct 靶基因-Ct GAPDH），以2-ΔΔCt代表BDNF mRNA 的相對表達量。重復測算3次，取平均值。

1.4 各組貓眼內直肌肌肉組織BDNF 蛋白檢測采用WESTERN Blotting 法。取四組貓眼內直肌組織，采集內直肌總蛋白。用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime Biotech）定量總蛋白，在上樣緩沖液中煮沸5～10 min。蛋白樣品用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離2 h，轉膜90 min。用5%脫脂牛奶與TBST溶液在室溫下封閉1h 后，與1：1 000 稀釋的一抗在4 ℃孵育過夜，然后在室溫下加入含有1：2 000 稀釋的辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）標記的二抗孵育1 h，最后曝光X 光片，并使用Scion NIH 圖像軟件（Scion Corporation， MD， USA）進行條帶分析。以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值代表BDNF 蛋白的相對表達量。重復測算3 次，取平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件（SPSS Inc.，IL，USA）進行數據處理。所得數據進行正態檢驗和方差齊性檢驗，正態分布的計量資料以-x ± s表示，組間兩兩比較采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組貓眼內直肌纖維橫截面積及肌衛星細胞數比較 對照組和各實驗組貓的眼內直肌肌纖維形態正常，排列整齊，無細胞腫脹和變性，各實驗組和對照組的內直肌肌纖維走向無明顯差異（見圖1）。A、B、C 組及對照組貓的眼內直肌肌纖維橫截面積分別為904.33 ± 40.08、797.33 ± 33.13、702.33 ±46.65、1 005.33 ± 40.81，肌衛星細胞數分別為34.00 ± 3.46、20.00 ± 4，7.67 ± 2.08、3.33 ± 4.16，與對照組比較，A、B、C 組貓的眼內直肌肌纖維橫截面積小、肌衛星細胞數少（P均＜0.05）。

圖1 各組貓的眼內直肌肌纖維形態

2.2 各組貓的眼內直肌BDNF mRNA 相對表達量比較 A、B、C 組及對照組貓的眼內直肌BDNF mRNA 相對表達量分別為0.51 ± 0.05、0.41 ± 0.04、0.10 ± 0.04、1.00 ± 0.10，與對照組比較，A、B、C 組貓的眼內直肌BDNF mRNA 相對表達量低（P均＜0.05）。

2.3 各組貓的眼內直肌BDNF 蛋白相對表達量比較 A、B、C組及對照組貓的眼內直肌BDNF 蛋白相對表達量分別為0.85 ± 0.11、0.66 ± 0.05、0.14 ±0.05、0.97 ± 0.09，與對照組比較，A、B、C 組貓的眼內直肌BDNF 蛋白相對表達量低（P均＜0.05）。

3 討論

目前，關于共同性外斜視的發病機制有解剖學、調節學、神經學和遺傳學等幾種理論，但仍未闡明［7］。近年來，一些研究［9］發現細胞因子與骨骼肌的損傷和修復有關，且在眼外肌中進行了研究，證實了細胞因子在眼外肌中的高表達；然而，目前仍不確定這些細胞因子是否參與了斜視的發生和發展，以及如何調節眼外肌的損傷和修復。因此，建立穩定、重復性好的共同性外斜視動物模型，研究相關細胞因子與斜視發生發展的相關性，不僅有助于深入了解共同性外斜視的發病機制，而且為探索斜視的非手術治療方法提供了新的思路。

骨骼肌不僅是負責機體運動功能的主要器官之一，同時也是人體最大的代謝和內分泌器官，能合成、分泌、表達多種細胞因子和多肽，這些活性物質被稱為肌源性因子（myokines），調節肌源性分化和肌肉再生，在骨骼肌的生長發育、新陳代謝以及一些疾病的病理過程中扮演了重要角色［10］。細胞因子屬于不同的細胞間信號轉導蛋白家族，在眼外肌細胞的增殖、分化和代謝過程中起著重要的調節作用。越來越多的研究發現，機械損傷、缺血和缺氧等病理刺激可以影響和改變細胞因子的活性［11］。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）和心肌營養素1（cardiotrophin 1，CT-1）可以增加幼雞成長期間眼外肌的力量和質量［12］。ANDERSON 等［13］表明，肌源性生長因子可以減少眼外肌的力量，這揭示了一種治療斜視的潛在生物學方法。LI 等［14］研究發現，外源性IGF-1 治療可促進貓斜視模型內直肌肌分化因子5（myocyte differentiation factor 5 ，Myf5）的表達，抑制轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）的表達。BDNF 是神經營養因子分泌蛋白家族中的一員，主要在大腦中產生，骨骼肌中也有合成，在神經肌肉功能中起重要作用。是視神經損傷后哺乳動物視網膜中一種有效的神經節細胞的神經保護劑［7］。

肌衛星細胞能夠在肌肉損傷時被激活，分裂并修復受損的纖維或形成新的肌纖維［9］。許多成熟哺乳動物未受損的眼外肌含有活躍的肌衛星細胞［8，11］，這表明眼外肌具有自我更新能力。研究［8］發現，肌肉來源的BDNF 在調節肌衛星細胞增殖分化以及肌肉損傷后的再生方面具有重要作用。WILLOUGHBY 等［15］對猴應用外源性BDNF 后發現慢肌纖維先受影響，與對照組外直肌神經肌肉接頭相比，慢肌纖維上的神經肌肉接頭更大，對于快肌纖維的神經肌肉接頭的大小或形態沒有影響。而慢肌纖維能夠維持眼外肌的張力，促進緩慢，持續的眼球運動。我們前期研究中將擬行外直肌后徙聯合內直肌縮短術共同性外斜視患者分為術前斜視度數40△～60△、60△～80△、80△～100△組，采用RT-qPCR 法檢測內直肌組織BDNF mRNA，結果發現，共同性外斜視患者內直肌BDNF mRNA 相對表達量隨斜視度數增加而減少。本研究結果中，共同性外斜視的貓模型發現，與對照組相比，實驗組的肌纖維橫截面積和肌衛星細胞的數量明顯減少。肌肉的橫截面積是決定肌肉力量大小的重要指標，橫截面積越大，肌肉收縮時產生的力量也就越大。實驗組貓內直肌形態發生明顯變化，力量減弱，引起斜視。這些數據不僅證明了貓的眼外肌與其他哺乳動物相似，具有活躍的肌衛星細胞，能夠自我更新和重塑，還證實了共同性外斜視所導致的一系列病理變化如肌纖維橫截面積減小、衛星細胞數量減少等與肌源性因子有關。此外，通過在動物模型中進一步研究發現，實驗組BDNF的mRNA 和蛋白表達均明顯降低，并呈下降趨勢。明確了共同性外斜視中內直肌BDNF 的表達與斜視度數、病程具有一定的相關性，推測其可能通過調節肌肉力量參與調控共同性外斜視的發生發展。有研究［8］表明，BDNF能夠調節肌肉衛星細胞的增殖和分化，以應對肌肉損傷后的修復。因此我們推測，在共同性外斜視發生時，內直肌的增殖、分化和代謝減少。BDNF 分泌減少，導致肌衛星細胞的增殖和分化能力也降低，阻礙了內直肌的生長、發育、修復和再生，最終使內直肌結構改變，力量減弱，眼位發生偏斜。此外，隨著共同性外斜視病程的延長，BDNF的表達呈明顯下降趨勢，推測BDNF 的表達下降可能促進了斜視病情的進一步加重，提示BDNF 可能與斜視的發生發展有一定的相關性。

綜上所述，共同性外斜視貓內直肌BDNF mRNA和蛋白表達降低，且隨病程延長降低更明顯。BDNF mRNA 和蛋白可能通過抑制貓內直肌肌肉衛星細胞數，參與共同性外斜視的發生發展。由于本研究只對截取的貓內直肌進行研究，共同性外斜視貓的外直肌及其他眼外肌組織中病理性改變及是其他調控因子尚需后續進一步研究。