lncRNA SNHG4通過EP300-SNHG4-GPX4軸抑制乳腺癌細胞鐵死亡

隋世堯 鄭瑋 楊子涵 龐達

作者單位：1.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科一病區(哈爾濱 150081);2.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院門診手術室

乳腺癌已成為威脅女性健康的頭號殺手,其發病率位居女性惡性腫瘤第一位,致死率位居第二位,僅次于肺癌,故乳腺癌的早診早治迫在眉睫[1]。鐵死亡(Ferroptosis)這一概念由Stockwell及其同事于2012年提出,依賴于細胞內活性氧(ROS)水平而與凋亡完全不同,其促進劑能夠有效殺傷凋亡抵抗的癌細胞[2]。谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathion peroxidase-4,GPX4)催化鐵死亡過程中谷胱甘肽中和ROS反應,已被證實是鐵死亡過程中的關鍵酶并與腫瘤的發生發展密切相關,其抑制劑RSL3已被證實可殺傷乳腺癌細胞并可協同增強順鉑對肺癌細胞的殺傷作用[3,4]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度為200～100 000 nt的非編碼RNA分子,其家族成員SNHG4位于第5號染色體上,全長1 100 bp。在腫瘤領域,SNHG4被廣泛認為是腫瘤促進因子:在骨肉瘤中,SNHG4與病人腫瘤大小及不良預后均呈正相關,SNHG4通過與miR-224-3p競爭性結合從而增強骨肉瘤細胞的增殖、侵襲以及上皮-間質轉化(EMT)能力[5];在宮頸癌中,SNHG4通過募集miR-148a-3p從而降低c-Met表達,最終促進腫瘤凋亡抑制[6];此外,在前列腺癌中,SP1可通過轉錄激活SNHG4,從而通過競爭性結合機制抑制miR-377表達,最終上調ZIC5表達從而增強癌細胞的增殖與轉移[7]。然而,SNHG4是否可影響乳腺癌細胞鐵死亡仍需要進一步研究。組蛋白乙?；腔虮磉_過程中重要的調控機制之一,乙?；慕M蛋白可吸引其他轉錄因子(如BRD4)的聚集并啟動下游基因表達[8]。E1A結合蛋白P300(E1A binding protein p300,EP300)是已知的組蛋白乙?；D移酶,可促進組蛋白乙?；瘡亩{控基因表達。在BRCA陰性乳腺癌中,EP300高表達被認為是腫瘤復發及轉移的高危因子[9];機制層面,EP300已被證實可促進乳腺癌細胞的EMT過程從而增強腫瘤轉移[10];另外,EP300可通過結合FOXA1增強子促進后者表達從而增強乳腺癌細胞的增殖。但是,目前EP300在乳腺癌中的研究僅局限于增殖與轉移,其是否可調控乳腺癌細胞的鐵死亡尚無報道。

本文通過系列實驗揭示SNHG4在乳腺癌組織中的表達情況及其與生存預后的關系,并探討SNHG4抑制乳腺癌細胞鐵死亡的相關機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2018年12月于我院接受手術治療的乳腺癌患者共100例,收集腫瘤組織及距腫瘤外緣3～5 cm的癌旁組織。整理患者臨床病理資料,包括患者年齡、腫瘤大小、免疫組化類型、淋巴結轉移、雌激素受體(Estrogen receptor,ER)及孕激素受體(Progesterone receptor,PR)狀態。納入標準:(1)患者自愿參與本研究并簽署知情同意書;(2)術前未經新輔助放、化療等干預措施;(3)均經外科手術治療;(4)病理學診斷為浸潤性乳腺癌。排除標準:(1)雙側乳腺癌;(2)男性乳腺癌;(3)Ⅳ期乳腺癌;(4)術前已接受新輔助治療,包括化療,內分泌治療或中藥治療。本實驗的組織收集已經過哈醫大附屬腫瘤醫院倫理委員會審查(KY2022-23)。

1.2 研究方法

診斷標準:雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子2(HER2)的表達水平采用免疫組化法檢測,分子分型參照2020版CSCO乳腺癌指南:(1)三陰性型:ER、PR及HER2均為陰性;(2)HER2陽性型:HER2過表達或擴增,ER、PR均為陰性,Ki67任意比例,或HER2過表達或擴增,ER陽性,PR任何,Ki67任意比例;(3)Luminal型:HER2陰性或者低表達,ER陽性,PR陽性,Ki67任意比例。

1.3 主要試劑

DMEM培養基、RPMI-1640培養基及Opti-MEM培養基購于美國Gibco公司,PBS購于中國Solarbio公司,GPX4兔抗人單克隆抗體、EP300兔抗人單克隆抗體、β-Actin鼠抗人單克隆抗體購于美國Abcam公司,DMSO購于中國Solarbio公司,CCK-8試劑盒購于中國Beyotime公司,干擾RNA片段si-SNHG4,si-EP300及SNHG4過表達質粒由上海吉瑪公司完成,引物合成由上海GeneRay公司完成。

1.4 細胞培養

本研究中主要培養了MDA-MB-468與Hs578T共兩種人源乳腺癌細胞系。MDA-MB-468和Hs578T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2培養箱進行培養,細胞系篩選應用的MDA-MB-231,HCC70及SUM159細胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2培養箱進行培養,BT549,MDA-MB-435,及HCC1937細胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2培養箱進行培養。

1.5 細胞轉染

細胞消化離心后加入至6孔板,而后補充2 mL細胞培養液/孔,每孔加入250 μL Opti-MEM培養基和Lipofectamine 2000轉染試劑7.5 μL充分混勻。再將siRNA混合液或過表達質粒加入至6孔板細胞中,待轉染48 h后提取RNA,72 h后提取蛋白用于后續實驗檢測,實驗應用轉染序列見表1。

表1 細胞轉染siRNA及過表達質粒序列

1.6 細胞增殖實驗(CCK-8)

細胞消化后離心,收集轉染shRNA 48 h后的細胞,接種96孔板,密度為5 000個/100 μL。實驗組別分別為空載體組(NC組),SNHG4敲降組(shSNHG4-1組、shSNHG4-2組),鐵死亡抑制劑組(Fer-1組),SNHG4過表達組,SNHG4敲降+鐵死亡抑制劑組(shSNHG4-1+Fer-1組、shSNHG4-2+Fer-1組),鐵死亡促進劑組(RSL3組),SNHG4敲降+鐵死亡促進劑組(shSNHG4-1+RSL3組、shSNHG4-2+RSL3組)以及SNHG4過表達+RSL3組,以上細胞均在敲降SNHG4后加入試劑,37℃,5%二氧化碳培養。每組細胞均設置3個復孔。加入細胞懸液約5 h后細胞基本貼壁,此時加入藥物(Fer-1,10 μM,RSL3,1 μM),作用24 h后加入10 μL CCK-8溶液,細胞培養箱內繼續孵育1 h,使用酶標儀測定490 nm吸光度。根據所測的吸光度值進行統計分析。

1.7 RT-PCR實驗

Real-time RCR反應使用Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑盒,總反應體系為10 μL,使用GAPDH作為內參,每個樣本均設置3個孔為平行對照(表2)。2-△△Ct法計算作為目的基因相對表達量,△△Ct=(目的基因Ct值-管家基因Ct值)實驗組-(目的基因Ct值-管家基因Ct值)對照組。根據此公式計算出目的基因相對對照組的表達量。共設置空載體組(NC)組,SNHG4敲降組(shSNHG4-1、shSNHG4-2組)以及SNHG4過表達組。細胞篩選實驗應用MDA-MB-468,MDA-MB-231,HCC1937,SUM159,HCC70,MDA-MB-435,BT549,Hs578T細胞系進行檢測。應用SNHG4中位表達值區分高低表達量,高于中位表達值定義為“高表達”,低于中位表達值定義為“低表達”。

表2 Real-time-PCR引物序列

1.8 Western blot實驗

細胞消化離心后進行RIPA裂解液處理提取蛋白,而后進行濃度測定并煮沸變性處理。配制好膠后,將膠板固定于相應電泳槽內,加入蛋白樣品,恒壓70 V進行電泳,而后經過轉膜(300 mA,90 min),封閉1 h,一抗經1∶1 000稀釋后進行4℃過夜孵育,以β-Actin為內參。次日PBST洗膜三次,應用熒光二抗室溫孵育1 h,再次PBST洗膜3次,應用化學發光超敏顯色劑(碧云天公司,碧云天公司)1∶1混合顯色。

1.9 鐵含量測定實驗

細胞消化后離心,棄掉上清后使用ScienCell公司生產的鐵含量測定試劑盒(ScienCell,8448)中的緩沖液(Assay Buffer)制備成200 μL的細胞懸液。4℃下13 000 g離心10 min,取上清。準備好稀釋樣品的溶液(實驗緩沖劑:還原劑:樣品=93∶2∶5)共1 mL,與等體積的工作液混合,離心5 min,取上清應用酶標儀測量590 nm吸光度。

1.10 丙二醛(MDA)含量測定實驗

細胞消化后離心棄掉上清后使用MDA含量測定試劑盒(南京建成公司,A003-1-2)中的5號提取液0.5 mL,混勻2 min,超聲破碎細胞制成懸液,取樣0.1 mL放置于1.5 mL離心管中,取樣0.1 mL放置于1.5 mL離心管中。配制上樣液,渦旋混勻,95℃水浴40 min,將液體分別取250 μL加入至96孔板中,使用酶標儀測定530 nm下各個孔的吸光度。

1.11 公共數據分析

SNHG4上游轉錄因子預測數據來源于JASPAR數據庫(http://jaspar.genereg.net/),SNHG4上游組蛋白修飾位點分析來源于ENCODE數據庫(www.encodeproject.org/)。

1.12 隨訪

采用門診復查和電話等方式了解病人術后情況。隨訪開始日期為患者初次診斷為浸潤性乳腺癌。隨訪截止日期為2023年2月。研究的終點包括無病生存期(Disease free survival,DFS)和總生存期(Overall survial,OS)。DFS指從病理確診為乳腺癌到首次觀察到復發的時間,OS指從病理確診為乳腺癌到隨訪結束或死亡的時間。

1.13 統計分析

實驗數據分析采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 17.0軟件,所有實驗均重復三次,計量資料數據以均數±標準差表示。相分析配對資料使用配對t檢驗,兩組間比較采用t檢驗,三組及以上比較使用方差分析。應用Pearson線性相關分析SNHG4與GPX4,以及EP300與SNHG4的相關性。生存資料的分析使用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG4在乳腺癌中的表達情況及與生存預后的關系

RT-PCR提示SNHG4在腫瘤組織的表達高于癌旁組織(t=9.658,P=0.001)(圖1A);SNHG4在侵襲轉移能力最強的Basal-Like型乳腺癌中表達高于Luminal型及HER-2型(圖1B,P<0.001),故后續實驗我們選擇Basal-Like型乳腺癌細胞系進行相關實驗。隨后我們選取ER(+)乳腺癌樣本34例,并隨機抽取剩余67例ER(-)乳腺癌樣本中的34例進行分析,發現SNHG4在預后較差的ER(-)乳腺癌中表達高于ER(+)者(圖1C,t=88.47,P<0.001)。SNHG4高表達與乳腺癌病人的OS及DFS短相關(圖1D-E,P<0.01),且SNHG4表達與腫瘤大小有關(P<0.001),與腫瘤轉移無關(表3)。以上結果說明SNHG4可能作為癌基因促進乳腺癌的發生發展。

圖1 乳腺癌患者SNHG4表達與病人生存預后的關系Figure 1 Relationship between SNHG4 expression and prognosis of breast cancer patientsNote:A.The expression of SNHG4 in tumor tissues was higher than that in normal tissues;B.The expression of SNHG4 was higher in Basal-Like breast cancer than that in Luminal and Her-2;C.The expression of SNHG4 in estrogen receptor-negative breast cancer samples was higher than that in estrogen receptor-positive breast cancer samples;D.The overall survival of breast cancer patients with high expression of SNHG4 was lower than those with low expression;E.The disease-free survival of breast cancer patients with high expression of SNHG4 was lower than those with low expression.*** P<0.001.

表3 乳腺癌患者SNHG4表達情況與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2 SNHG4低表達對乳腺癌細胞鐵死亡的誘導作用

細胞篩選實驗發現SNHG4在MDA-MB-468細胞系中表達最高(P<0.01),在Hs578T細胞系表達最低(P<0.01),故后續實驗應用MDA-MB-468細胞系進行SNHG4敲降實驗,應用Hs578T細胞系進行SNHG4過表達實驗(圖2A,P<0.05)。構建SNHG4敲降/過表達細胞系(見材料與方法1.5)后(圖2B-C,P<0.01)我們發現SNHG4低表達可導致細胞活力降低(圖2D,P<0.01),過表達SNHG4組細胞活力增強(圖2E,P<0.01)。應用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)后我們發現SNHG4低表達介導的細胞活力下降可被Fer-1所逆轉(圖2D,P<0.01),隨后我們對敲降/過表達SNHG4后的細胞內鐵含量及ROS水平進行了檢測(ROS水平應用脂質過氧化產物MDA水平檢測),結果表明敲降SNHG4后細胞內ROS及鐵含量均上調(圖2F,G,P<0.01),而過表達SNHG4后細胞內ROS及鐵含量均下調(圖2H,I,P<0.01)。以上研究表明SNHG4與乳腺癌細胞鐵死亡負相關。

圖2 SNHG4對乳腺癌細胞鐵死亡的抑制作用Figure 2 SNHG4 showed an inhibited effect of ferroptosis on breast cancerNote:A.The expression of SNHG4 in Basal-Like breast cancer cell lines;B.SNHG4 knockdown plasmid efficiency;C.SNHG4 overexpression plasmid efficiency;D.The decrease of cell viability caused by SNHG4 knockdown could be reversed by Fer-1;E.Overexpression of SNHG4 resulted in enhanced cell viability;F.The levels of intracellular ROS were up-regulated after SNHG4 knockdown;G.The content of intracellular iron was up-regulated after SNHG4 knockdown;H.After overexpression of SNHG4,the levels of intracellular ROS were down-regulated;I.After overexpression of SNHG4,the content of intracellular iron was down-regulated.*** P<0.001.

2.3 SNHG4低表達與鐵死亡促進劑的乳腺癌細胞的協同殺傷作用

我們首先檢測了SNHG4與GPX4的關系,通過對本單位生物樣本庫乳腺癌樣本(n=100)進行分析發現SNHG4與GPX4表達正相關(圖3A,表2,P<0.01),故我們應用RSL3與SNHG4敲降聯合處理乳腺癌細胞,研究表明RSL3聯合SNHG4敲降可協同殺傷乳腺癌細胞,其效果優于單藥作用(圖3B,P<0.01)。進一步研究表明,聯合用藥后細胞內ROS水平及鐵含量均得到協同性增強(圖3C,D,P<0.01),而過表達SNHG4后RSL3的殺傷作用降低(圖3E,P<0.01),ROS及鐵含量亦被逆轉(圖3F,G,P<0.01)。這說明抑制SNHG4聯合鐵死亡促進劑可作為治療乳腺癌的手段。

圖3 敲降SNHG4聯合鐵死亡促進劑乳腺癌細胞的協同殺傷作用Figure 3 Synergistic effect of SNHG4-knock-down combined with inducers of ferroptosis on anti-cancerNote:A.SNHG4 was positively correlated with GPX4 expression;B.SNHG4 killed tumor cells synergically with iron death promoter RSL3 after knockdown;C.After knockdown,SNHG4 synergistic with iron death promoter RSL3 up-regulated the levels of intracellular ROS;D.After knockdown,SNHG4 synergized with iron death promoter RSL3 up-regulated the content of intracellular iron;E.Overexpression of SNHG4 could inhibit the antitumor effect of RSL3;F.Overexpression of SNHG4 could reverse the up-regulation effect of RSL3 on the levels of intracellular ROS;G.Overexpression of SNHG4 could reverse the up-regulation effect of RSL3 on the content of intracellular iron.***P<0.001.

2.4 SNHG4抑制乳腺癌細胞鐵死亡的作用機制

構建SNHG4敲降的乳腺癌細胞系后對GPX4表達進行了檢測,發現SNHG4敲降后GPX4表達下調(圖4E,P<0.01),因此SNHG4對鐵死亡的抑制作用可能通過調控GPX4表達實現。JASPAR數據庫分析得知,組蛋白乙?；D移酶EP300可能作為轉錄因子上調SNHG4表達(表4),這一點我們也通過分析ENCODE數據庫得到證實(圖4A),SNHG4上游確實存在EP300結合位點,且生物樣本庫分析表明EP300與SNHG4表達正相關(圖4B,P<0.01)。隨后我們進行RT-PCR實驗發現敲降EP300(圖4C,P<0.01)后SNHG4表達下調(圖4D,P<0.01),蛋白印跡結果表明敲降EP300后GPX4表達下調(圖4F,P<0.01)。因此推測EP300作為轉錄因子上調SNHG4表達,后者通過上調GPX4表達抑制乳腺癌細胞鐵死亡。

圖4 SNHG4通過EP300-SNHG4-GPX4軸抑制乳腺癌細胞鐵死亡Figure 4 SNHG4 inhibited ferroptosis of breast cancer cells through EP300-SNHG4-GPX4 axisNote:A.There are binding sites upstream of SNHG4;B.The expression of SNHG4 was positively correlated with histone acetyltransferase EP300;C.Knockdown efficiency of EP300 plasmid;D.The expression of SNHG4 was down-regulated after EP300 knockdown;E.GPX4 expression was down-regulated after SNHG4 knockdown;F.The expression of GPX4 was down-regulated after EP300 knockdown.***P<0.001,when compared with the Scramble group.

表4 Jaspar數據庫預測SNHG4上游調控因子

3 討論

乳腺癌是全球女性最易罹患的惡性腫瘤,其病程中出現的多器官轉移是導致病人死亡的主要原因。乳腺癌的發生發展是諸多因素相互作用、相互制約、相互影響下的極其復雜的病理過程,故乳腺癌的發病機制需從多層面多角度進行解析[12]。雖然在臨床工作中可采用手術、化療、放療、內分泌治療以及靶向治療等多種方法治療乳腺癌,仍有部分病人因乳腺癌死亡。鐵死亡已被證實可殺傷乳腺癌細胞,但其內在機制仍需要進一步研究,包括鐵死亡在乳腺癌中的調控靶點以及鐵死亡促進劑對乳腺癌細胞的殺傷能力等[13]。LncRNA與腫瘤發生發展的多個階段具有密切聯系,其扮演的角色涉及多個生物學過程及分子信號通路。然而lncRNA在鐵死亡中的作用仍需要進一步挖掘。目前研究表明lncRNA GABPB1-AS1通過下調其反義基因GABPB1從而降低過氧化物酶PRDX5的表達,增強肝癌細胞內脂質過氧化并引發鐵死亡,靶向GABPB1-AS1可有效殺傷肝癌細胞而對臨近正常肝細胞無明顯影響[14];此外,膠質瘤細胞可通過上調DLEU1表達抑制腫瘤細胞鐵死亡[15]。隨著鐵死亡相關分子生物學技術的發展,部分研究已發現lncRNA對鐵死亡的調控靶點。LncRNA MT1DP可通過競爭性結合miR-365a-3p從而下調抗氧化因子NRF2表達,增強鐵死亡促進劑Erastin對肺癌細胞的殺傷能力[16]。另有研究發現lncRNA P53RRA可通過增加p53入核從而促進乳腺癌細胞的鐵死亡,p53蛋白的核內定位降低了鐵死亡抑制因子SLC7A11表達,故推測P53RRA促進p53的核定位導致GSH合成抑制及鐵死亡[17]。此外,在一項對非小細胞肺癌細胞接受小分子抗癌藥物XAV939處理后的研究發現,224個lncRNA表達異常,且功能主要集中于通過SLC7A11調控鐵死亡過程[18]?？梢妉ncRNA與鐵死亡之間有著千絲萬縷的聯系,應用干擾lncRNA表達誘導乳腺癌細胞鐵死亡或可成為未來治療乳腺癌的新思路。

本研究首先通過系列實驗明確了SNHG4在乳腺癌組織高表達,且與病人的生存預后負相關。隨后應用細胞學實驗對干擾SNHG4表達后乳腺癌細胞的增殖能力以及鐵死亡相關指標進行了檢測,發現敲降SNHG4導致乳腺癌細胞發生鐵死亡,故我們推測應用鐵死亡促進劑或可增強敲降SNHG4對乳腺癌細胞的抑制作用,體外實驗證明敲降SNHG4聯合RSL3可協同殺傷乳腺癌細胞。目前,GPX4作為鐵死亡的關鍵酶已被多篇報道,故本研究對GPX4與SNHG4的關系進行研究,發現敲降SNHG4后GPX4表達下調,這也解釋了SNHG4低表達能夠與GPX4抑制劑RSL3協同殺傷乳腺癌的現象。隨后我們對SNHG4上游進行了探索,發現組蛋白乙酰轉移酶EP300可能在轉錄層面增強SNHG4表達。故未來或可通過組蛋白乙?；敢种苿┞摵蟁SL3治療乳腺癌。

然而,本實驗仍然存在著不足之處,首先,鐵死亡的發生不僅限于GPX4表達改變,其他鐵死亡相關因子,如SLC7A11,ACSL4等需要進一步研究以發現他們與SNHG4的表達相關性;另外SNHG4的作用機制為通過內源性競爭結合miRNA從而促進下游基因表達,故SNHG4是否可通過相同機制促進GPX4表達需要進一步挖掘;最后,由于鐵死亡不僅發生在乳腺癌組織,故鐵死亡促進劑聯合SNHG4干擾治療的并發癥仍需要臨床試驗探索。綜上所述,本實驗為未來研究lncRNA與乳腺癌細胞鐵死亡提供了新的思路,拓寬了乳腺癌治療范疇,為乳腺癌的治療方案優化提供了線索。