PEDV Nsp10 基因真核表達載體的構建及蛋白的表達

牛欣雨，鄭亮，魏佳琪，武峰峰，吳志軍，3，張華，，3，曹宏偉，，3

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學動物科技學院；3.鹽城師范學院）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起一種急性腸道傳染病，主要以高度接觸性傳染而廣泛傳播[1]。感染此病毒的豬多伴有嚴重的腹瀉、嘔吐、脫水等特征，多感染哺乳仔豬，且具有較高的感染率和死亡率。不同年齡段的豬感染率不同，但一般年齡越小的豬感染率越高，死亡率也越高[2]。豬流行性腹瀉首次爆發于歐洲英國，但目前已經成為威脅到包括中國、韓國、日本等在內的亞洲各個國家養豬業的嚴重傳染性疾病，給亞洲乃至世界各國養豬業造成了致命性的打擊[3]。

PEDV 是一種正鏈單股RNA 病毒，基因組全長約為28 kb[4-6]。PEDV 基因組共編碼蛋白21 種，其中包括4 種結構蛋白（E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白及S 蛋白）和16 種非結構蛋白Nsp1-16 以及一個輔助蛋白ORF3[7-9]。這些蛋白共同協調著病毒的復制與增值。

Nsp10 是PEDV 編碼的非結構蛋白，由135 個氨基酸殘基構成，是一種具有核苷-2-O’-甲基轉移酶活性的輔助蛋白[10]。生物信息學分析發現Nsp10 蛋白是一種鋅指結合蛋白，在冠狀病毒（包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）中，和鋅螯合的所有氨基酸均比較保守[11]。此外，也有研究表明，SARS-Cov Nsp10 蛋白可以與DNA或單雙鏈RNA 中非特異性的核苷酸結合并且可通過與多種蛋白如Nsp1、Nsp7 等相互作用來參與復制復合體的形成[12-13]；SARS-Cov-2 Nsp10 蛋白可以拮抗Ⅰ型干擾素產生的免疫應答反應[14]；MHV Nsp10蛋白可以結合鋅離子并且在體外與ssDNA、dsDNA、ssRNA 及tRNA 結合[15]；冠狀病毒的Nsp10 蛋白是一種可以激活多種復制酶的關鍵輔助因子，它可以與Nsp14 和Nsp16 相互作用，并調控它們各自的外顯子和核糖-2’-O-甲基轉移酶的活性[16-17]；豬δ 冠狀病毒Nsp10 蛋白以一種不依賴于鋅指結構域的方式拮抗β-干擾素的產生[18]。這些結果說明，對于冠狀病毒來說Nsp10 蛋白對基因組和亞基因組RNA 合成以及病毒多聚蛋白的加工有著極其重要的作用[19-20]。

到目前為止，對于冠狀病毒Nsp10 作用機制研究的報道還相對較少，對于PEDV Nsp10 蛋白的研究也相對較少。研究通過構建PEDV Nsp10 基因真核表達載體，利用免疫印跡技術（Western Blot）與間接免疫熒光技術鑒定其表達及亞細胞定位情況，為進一步探究PEDV Nsp10 蛋白的生物學功能以及特性奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

IPEC-J2 細胞由生物技術中心509 實驗室于-80 ℃凍存復蘇；小鼠抗Myc 單抗（mAb）、小鼠抗β-actin單抗（mAb）、山羊抗小鼠辣根酶標記IgG 以及FITC標記的山羊抗小鼠IgG 均購自北京中衫金橋生物技術公司；DMEM 培養基、胎牛血清（fetal cattle serum，FBS）和LipofectamineTM2000購自英濰捷基（Invitrogen）上海貿易有限公司；質粒小提試劑盒和膠回收試劑盒均購于Omega 公司；限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、2×Seamless 無縫克隆酶、PCR 及反轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司；特異性引物合成及重組質粒的序列測定均由擎科生物（北京）公司完成；病變組織豬小腸由生物技術中心509 實驗室保存；試驗選用的DH5α 感受態細胞及所需的pCMV-Myc 載體均由生物技術中心509 實驗室保存。

1.2 引物設計及表達載體構建路線

找出已經發表在NCBI-GeneBank 上的PEDV（NC_003436.1）標準序列作為模板序列，利用primer 5 軟件設計PEDV Nsp10 基因的特異性上下游引物，特異性上游引物序列：GCCA TGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGTAAACAAACAGAACAGGCTAT-3（含EcoR Ⅰ位點），特異性下游引物序列：CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAATGGAT -CTGTCACAAG TG（含XhoⅠ位點）。利用酶切連接的方式將PEDV Nsp10 基因插入pCMV-Myc 的EcoRⅠ/XhoⅠ位點之間。構建以pCMV-Myc 為載體的PEDV Nsp10 蛋白融合表達載體。

1.3 擴增PEDV Nsp10 基因

將病變組織豬小腸用液氮進行研磨，將其放于1.5 mL EP 管中，劇烈搖晃1 min 后靜止10 min，加入冰冷的三氯甲烷試劑，快速搖晃20 s。靜止15 min后，在轉速為12 000 r·min-1，4 ℃離心機中離心15 min。離心停止后，取離心管中的上層澄清液于新的EP 管內，將600 μL 異丙醇加入裝有上述澄清液的EP 管中，輕輕搖晃15 s，讓兩者混勻，靜止時間為10 min。隨后4 ℃離心機中離心10 min，轉速為12 000 r·min-1。倒掉上清，向沉淀中加入75%的乙醇（用DEPC 水現配現用）600 μL，靜止10 min。倒掉上清，吹干剩余液體，向EP 管中的沉淀加入20 μL 的DEPC 水助溶，靜止10 min，在-80 ℃冰箱中保存。試驗過程中所用的耗材需要提前用DEPC 水處理，4 ℃離心機需提前預冷。

RNA 提取完畢后，加入Oligo（dT）1 μL、Specific Primer 2 μL、DEPC 水2 μL；反應條件為70 ℃10 min。向上述管中加入以下試劑混合液，dNTP mix（10 mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、RNase M-MLV 1 μL、DEPC 水1 μL，總反應體系5 μL；將上述液體混勻后放入PCR 儀中，PCR 程序為：30 ℃10 min，42 ℃保溫60 min，70 ℃保溫15 min。以此得到的cDNA 為模板，加入上下游引物各0.2 μL，buffer 3 μL，dNTP 2 μL，PCR 酶0.13 μL，去離子水13.47 μL，總反應體系為20 μL；將上述液體混勻后放入PCR 儀中，PEDV Nsp10 基因PCR 程序為：94 ℃10 min；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃1 min（共35 次循環）；72 ℃10 min。結束后點樣跑膠，之后切下本試驗的目的條帶，利用試劑盒對目的產物進行回收，回收到的目的片段溶在20 uL 去離子水中-20 ℃冷凍冰箱中保存。

1.4 Nsp10 基因真核表達載體的構建及鑒定

將Nsp10 基因片段和pCMV-Myc 載體分別用EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切，試驗條件為37 ℃，2 h，利用Omega 試劑盒進行膠回收。將切下的DNA 膠用700 μL Binding Buffer 于60 ℃水浴鍋中溶解10 min。將溶解后的混合液體倒入收集柱，于離心機中12 000 r·min-1離心1min，該過程重復一次。隨后棄掉下管液體，向上柱加入300 μL Binding Buffer 將其溶解，12 000 r·min-1離心1 min。棄去下層液體，向上管中加入700 μL Wash Buffer，12 000 r·min-1離心1 min。丟棄下管液體13 700 r·min-1空離2 min。離心后向上管加入30 μL 已經加熱到60 ℃左右的去離子水，靜止溶解5 min 后13 700 r·min-1離心2 min，得到純化的基因片段和載體片段。將上述兩種純化所得到產物，加入2×Seamless 無縫克隆酶及去離子水，總體系為10 μL，于PCR 儀中50 ℃15 min。連接產物轉化涂板，于培養箱培養12 h。挑取大小飽滿的單一菌落，于37 ℃搖床培養10-12 h 后，提取質粒。經PCR 和雙酶切鑒定成功后，于-20 ℃保存。取出10 μL 質粒送至公司進行測序，將正確質粒命名為pCMV-Myc-Nsp10。

1.5 Western Blot 檢測

將IPEC-J2 細胞均勻鋪在24 孔板中，待細胞密度長到80 %左右時，進行轉染，步驟如下：用Lipofectin2000分別將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp10 質粒轉染至細胞中，將轉染后的細胞板于37 ℃5%CO2培養箱培養。培養6 h 以后，將原24 孔板中的DMEM 換為10% FBS，繼續培養18 h 后，收取蛋白樣品。收樣：PBS 輕輕清洗細胞2～3 次后，每孔加入30～50 μL RIPA 裂解液裂解細胞半個小時，該過程需要在4 ℃低溫下進行，用槍頭刮取細胞，4 ℃離心機12 000 g 離心10 min，吸取上清裂解液至新的EP 管中。加入5×Loading Buffer，100 ℃沸水浴煮樣10 min，隨后12 000 g 離心10 min。跑膠：配膠，等待膠凝固以后，組裝膠和電泳槽，在確定不漏的情況下倒入1×SDS 電泳液，插上電極，分離蛋白樣品；轉膜：將膠板撬開，按照條帶大小切下對應膠條，組裝轉膜裝置，用PVDF 膜吸附蛋白，冰水混合物中轉膜電壓200 V，電流240 A，時間為2 h。封閉：取10 mL 1×TBST，向里面添加0.5 g 脫脂奶粉。將PVDF 膜放入混勻后的封閉液中，搖床封閉孵育2 h。結束后用1×TBST 溶液洗膜2 h，期間需要更換1×TBST。孵育抗體：用鼠源β-actin 單抗（1∶1 000）、鼠源Myc 單抗（1∶1 000）作為一抗，山羊抗小鼠辣根酶標記IgG（1∶1 000）作為二抗各孵育2 h，每次孵育結束后需用1×TBST 溶液洗膜2 h，洗膜時間，每次15 min；每次洗膜均在搖床上進行。曝光：用AI600 儀器曝光，保存結果圖片。

1.6 間接免疫熒光

細胞傳代爬片，待細胞密度長到60%左右時，用Lipofectin2000分別將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp10 質粒轉染至IPEC-J2 細胞中，于37 ℃5% CO2培養箱培養，6 h 后將DMEM 更換為10% FBS。繼續培養18 h 后，吸棄上層細胞培養基，之后用滅菌后的PBS 洗細胞2 次，每孔加入500 μL 4%的多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS 洗細胞共3 次，15 min·次-1。加入0.1% Triton X-100，室溫透膜20 min；PBS 清洗細胞3 次，15 min·次-1；加入5% BSA 封閉2 h（5% BSA需要現用現配），用鼠源Myc 單克隆抗體（1：500）作為一抗孵育1 h；PBS 洗3 次；加入熒光素標記的山羊抗小鼠IgG（1∶500）作為二抗室溫避光孵育2 h；孵育結束后PBS 洗3 次。最后取干凈且滅菌后的載玻片，滴少量的封片劑，用針頭挑出爬片，將帶有細胞的面放在封片劑上，用紙巾輕輕將多余的液體吸干，壓緊，再將指甲油均勻涂抹在爬片周圍，阻止細菌進入細胞中。將載玻片在避光處晾干，待片子干燥后用熒光顯微鏡觀察拍照，并保存圖片。

2 結果與分析

2.1 Nsp10 基因片段的PCR 擴增

在研究中，利用設計的PEDV Nsp10 的特異性上、下游引物對其進行PCR 擴增，電泳后在大約在400 bp 處出現目標條帶，即為特異的Nsp10 基因片段，結果如圖1 所示。

2.2 真核表達載體pCMV-Myc 的雙酶切

通過借助pCMV-Myc 真核表達載體連接目的基因來完成重組質粒的構建，需對兩者產生相同的酶切位點，借助EcoRⅠ與XhoⅠ對上述兩種基因同時進行雙酶切。結果如圖2 所示，目的基因與載體雙酶切成功。

圖2 Nsp10 基因片段與pCMV-Myc 載體的雙酶切Fig.2 Double enzyme digestion of Nsp10 gene fragment and pCMV-Myc vector

2.3 重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 的PCR 鑒定

利用無縫克隆酶2×Seamless 將目的基因和載體的酶切產物進行連接，得到重組質粒pCMV-Myc-Nsp10。利用PCR 的方法對所得的重組質粒進行初步鑒定，電泳結果發現在400 bp 附近處出現目標條帶，結果如圖3 所示。

圖3 重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 的PCR 鑒定Fig.3 PCR Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp10

2.4 重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 的雙酶切鑒定

為了鑒定重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 是否構建成功，將質粒進行雙酶切鑒定，加入EcoRⅠ酶，XhoⅠ酶，Buffer，去離子水，總體系10 μL 置于37 ℃水浴鍋中2 h。雙酶切產物電泳后在3 000 bp 和405 bp左右處出現兩條條帶，條帶大小與理論大小相符，結果如圖4 所示。

圖4 重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 的雙酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp10

2.5 重組表達載體序列比對

為了鑒定重組質粒序列與NCBI 公布的Nsp10基因序列的同源性，取10 μL 重組質粒pCMV-Myc-Nsp10，送至擎科生物（北京）公司進行測序，將NCBI網站上公布的PEDV Nsp10 原始序列與所得到的重組質粒測序結果進行了多序列比對，結果如圖5 所示其同源性高達99%。

圖5 pCMV-Myc-Nsp10 與CV777 毒株序列比對Fig.5 Sequence alignment between pCMV-Myc-Nsp10 and CV777 strains

2.6 重組表達載體在細胞中的分布

研究主要以間接免疫熒光技術探究了pCMVMyc-Nsp10 在IPEC-J2 細胞中的分布情況以及定位的情況。免疫熒光結果顯示，重組表達載體pCMVMyc-Nsp10 質粒在IPEC-J2 細胞中成功表達，大部分分布在細胞質中少數分布在細胞核，結果如圖6 所示。

圖6 Nsp10 蛋白在IPEC J2 細胞中的表達Fig.6 Expression of Nsp10 protein in IPEC-J2 cells

2.7 Western Blot 檢測IPEC-J2 細胞中表達的重組蛋白

為了確定重組質粒pCMV-Myc-Nsp10 在IPECJ2 細胞中的表達情況，先后利用小鼠抗Myc 標簽單抗及FITC 標記的山羊抗小鼠二抗對空載體pCMVMyc 及重組表達載體pCMV-Myc-Nsp10 進行Western Blot 檢測，其結果顯示，重組pCMV-Myc-Nsp10在IPEC-J2 細胞中成功表達，結果如圖7。

圖7 Western Blot 鑒定蛋白融合表達Fig.7 Western Blot Determination of fusion protein expression

3 討論

PEDV 是引起豬流行性腹瀉的一種單股正鏈RNA 病毒，該病毒能引起不同年齡段的豬出現厭食、腹瀉、脫水，并引起不同年齡段的哺乳仔豬大量死亡，死亡率高達百分之九十以上[21]。豬流行性腹瀉首次爆發于英國，2010 年在我國大規模的爆發，給我國養豬業帶來了前所未有的打擊[22]。當PEDV 感染豬小腸上皮（IPEC-J2）細胞后，會破壞機體的免疫系統，并調控先天免疫應答，從而引起細胞損傷[23]。

在PEDV 全基因組中，除5’端帽子和3’端poly（A）尾等結構，還包含5’非翻譯區（UTR）結構、七個開放閱讀框（ORF1a，ORF1b 和ORF2-6）和3’非翻譯區（UTR）結構[24-25]。其中，兩個較大的開放閱讀框ORF1a 和ORF1b 占據了PEDV 全基因組將近三分之二的部分，用來編碼基因組的非結構蛋白（Nonstructural proteins，Nsps），即Nsp1-Nsp16，這些非結構蛋白不僅調控著各種病毒復制相關的酶活性，而且對宿主免疫系統也有著一定的影響[26]。

在這些非結構蛋白中，有很多具有酶活性的重要蛋白，這些蛋白是保證PEDV 復制的主要關鍵酶[27]。例如：Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14 和Nsp15 等。其他的非結構蛋白分別在病毒的成熟、轉錄調節、復制、代謝和出芽等方面都有一定的作用效果，但是還未見有研究報道其具體地作用機制[28]。有研究報道，PDCov 的Nsp10 蛋白可以以不依賴于其鋅指結構域的方式拮抗β 干擾素的產生[29]；冠狀病毒Nsp10/Nsp16 甲基轉移酶可被Nsp10 衍生肽靶向以減少病毒的復制和發病機制[30]。但目前關于PEDV 以及其編碼的非結構蛋白Nsp10 的表達及生物學功能研究的試驗或者文獻相對較少。所以，探究PEDV Nsp10 蛋白在調控病毒復制或影響細胞免疫方面具有重要的意義。因此，PEDV Nsp10 重組質粒的構建為后續研究其在PEDV 復制過程中具有重要的作用。

4 結論

研究主要利用RT-PCR 的方法，擴增得到長度為405 bp 的PEDV Nsp10 基因，與GenBank 上已經公布的PEDV Nsp10 基因序列的同源性高達99%。隨后，將PEDV Nsp10 基因插入到pCMV-Myc 表達載體中，成功構建了pCMV-Myc-Nsp10 重組表達載體。試驗為后續研究關于PEDV Nsp10 蛋白的生物學功能和其在抗病毒反應中所發揮的作用等方面奠定了研究基礎。