LncRNA CoroMarker在急性心肌梗死患者外周血單核細胞中的表達及意義

陳云憲，張文濤，梁家榮，涂少文，周錫文，陳志鑫，夏玨，唐良秋

ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是一種表現為相應心電圖導聯ST段抬高的急性冠脈閉塞性疾病，有較高的發病率和死亡率，常引起心源性死亡、慢性心力衰竭、心律失常等心臟并發癥[1]。冠狀動脈（冠脈）粥樣硬化引起冠脈狹窄和斑塊破裂導致急性血栓形成是STEMI的主要發病過程，而炎癥反應則是貫穿整個發病過程的重要環節[2]。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，越來越多研究證實許多不同類型的LncRNA在STEMI的發病中起著重要作用，包括調控心肌細胞凋亡、自噬、壞死、氧化應激、炎癥等[3]。最近有學者發現[4]，冠心病患者的外周血單核細胞（PBMCs）和血漿中LncRNA OTTHUMT00000387022（CoroMarker）表達明顯增加，其中LncRNA CoroMarker診斷冠心病的AUC高達0.940，是冠脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑囊环N新型特異性生物標志物。CoroMarker與炎癥呈負相關的基因聚集在一起，可能起到調控炎癥的作用。對于LncRNA CoroMarker是否在STEMI中也存在著生物學作用目前尚未見相關研究，本文通過分析STEMI患者PBMCs中CoroMarker和血漿細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達水平，闡述CoroMarker在STEMI中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組連續選取2020年7月至2021年1月于廣東省韶關市粵北人民醫院心血管內科住院確診為STEMI的患者30例作為研究對象（STEMI組），其中男性36例，女性14例，年齡43~72（60.03±8.69）歲。納入標準：所有STEMI患者均符合中華醫學會2019 年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》診斷標準[5]，均行急診冠脈介入手術，證實存在冠脈急性閉塞。排除標準：嚴重肝腎功能損害、重癥感染性疾病、心力衰竭、嚴重的心臟瓣膜疾病、嚴重心律失常、惡性腫瘤、血液系統性疾病和自身免疫系統疾病。另選取本院體檢中心同時期健康體檢的無冠心病人群30例作為對照組，其中男性30例，女性20例，年齡40~67（56.77±7.68）歲。本研究經本院倫理委員會批準，經患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集一般臨床資料、生化指標和預后資料收集所有研究對象一般臨床資料，包括性別、年齡、血壓、吸煙史、高血壓史及糖尿病史等。收集血常規、血脂、電解質、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、血肌酐（SCr）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、左室射血分數（EF）等檢查指標。記錄患者住院期間和出院后1年內主要不良心血管事件（MACE）發生情況，包括：心源性死亡；再發急性心肌梗死；心絞痛反復發作；惡性心律失常（如室性心動過速、心室顫動、嚴重的心動過緩）；支架內血栓形成；心源性休克；心力衰竭：包括急性心力衰竭或心功能評定為紐約心臟協會（NYHA）Ⅲ~Ⅳ級。

1.2.2 CoroMarker和MCP-1檢測所有入選對象入院后即刻采集5 ml靜脈血于EDTA抗凝管中，控溫離心機4 ℃、3000 r/min離心血液樣本10 min。吸取上層血漿樣本至1.5 mL離心管中，保存于超低溫冰箱（-80 ℃），待樣本收集完畢后統一采用ELISA法檢測血漿MCP-1水平。離心下層血液樣本加入淋巴細胞分離液2.5 mL，以20 ℃、400 g的條件離心30 min，提取PBMCs。使用Trizol法提取RNA，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。qRTPCR法檢測PBMCs中CoroMarker的表達情況。根據Genebank中CoroMarker序列，使用primer 6.0軟件設計引物（表1）。

表1 實驗用PCR 引物序列及擴增片段大小

1.3 統計學分析所有數據均采用SPSS 26.0統計學軟件分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，正態分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗，非正態分布的計量資料兩組間比較采用非參數檢驗Mann-Whitney U檢驗；計數資料采用例數（構成比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。CoroMarker對STEMI的診斷價值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，對預后的影響采用多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料比較兩組人群性別構成、年齡無統計學差異（P＞0.05），但高血壓病、糖尿病、LDL-C、總膽固醇等心血管危險因素存在統計學差異（P＜0.05），表2。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 兩組患者外周血單核細胞CoroMarker和血漿MCP-1的表達水平LncRNA CoroMarker在STEMI組患者外周血單核細胞CoroMarker相對表達量為0.21±0.25，與對照組的相對表達量相比明顯下降，差異有顯著統計學差異（P＜0.01，圖1A）。STEMI組患者的血漿MCP-1 濃度高于對照組[（173.06±9.76）pg/mL vs.（144.15±10.59）pg/mL，P=0.032，圖1B]。Pearson相關性分析提示STEMI組CoroMarker的Ct值與血漿MCP-1濃度成正相關（r=0.568，P＜0.01），即外周血PBMCs中CoroMarker的表達水平與血漿MCP-1濃度成負相關性（圖1C）。

圖1 兩組患者外周血單核細胞CoroMarker（A）和血漿MCP-1（B）的表達水平比較；MCP-1與CoroMarker相關性分布散點圖（C）

2.3 CoroMarker作為STEMI診斷標志物的ROC分析ROC曲線分析顯示LncRNA CoroMarker的AUC為0.806（95%CI：0.705~0.920，P＜0.001）。診斷STEMI的敏感度和特異性分別為75.0%、76.7%，cut-off值為CT值12.02（圖2）。

圖2 CoroMarker診斷STEMI的ROC曲線

2.4 CoroMarker與STEMI患者預后的相關性追蹤患者住院期間及出院后1年主要不良心血管事件（MACE）發生情況，包括心源性死亡、心室顫動、室性心動過速、再發急性心肌梗死、反復心絞痛發作、心力衰竭、新發腦梗死。住院期間發生心源性死亡1例，心室顫動1例，室性心動過速1例，心力衰竭4例。出院后1年內，再發心絞痛發作5例，再發急性心肌梗死1例，新發腦梗死1例，心力衰竭5例，室性心動過速1例。多因素Cox回歸分析發現CoroMarker是STEMI患者住院期間發生MACE事件的保護因子（HR=0.28，95%CI：0.08~0.96，P=0.042），但與STEMI患者出院1年內發生MACE事件無明顯相關性（HR=0.78，95%CI：0.47~1.29，P=0.326），圖3。

3 討論

急性心肌梗死（AMI）是全球發病率和死亡率的主要原因之一，AMI實質上是一種心肌壞死和炎癥反應的過程，炎癥程度與缺血再灌注損傷、不良心臟重構、心肌梗死面積和預后不良有關。研究認為，促炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白介素-6（IL-6）和白介素-1（IL-1）以及脂肪因子脂聯素等水平升高與高死亡率和發病率有關。相反，抗炎癥細胞因子，如白介素-10（IL-10）、omentin-1等可抑制AMI誘導的炎癥反應，與更好的預后相關[6]。促炎和抗炎細胞因子的失衡是改變AMI預后的重要因素，對于AMI炎癥因子和相關信號通路的研究一直是心血管領域的研究熱點。本研究發現，LncRNA CoroMarker是STEMI的一個重要生物標志物，可能通過調控相關炎性因子參與STEMI的發病過程。

許多LncRNA已被證實在AMI中起著重要的調控炎癥和心肌凋亡的作用[7]。如LncRNA MIAT、MALAT1、MDRL等在AMI中上調表達，而ANRIL、HOTAIR、MDRL等表達水平下降，可通過調控不同的信號通路或自噬等，參與心肌壞死、氧化應激、炎癥、線粒體功能調節和鈣超載[3,8]。由于AMI患者的死亡率很高，早期發現和治療可顯著改善患者預后。LncRNA具有高度的組織特異性，也是存在于血漿、血清、尿液和其他體液樣本中的相對穩定的二級結構。因此，LncRNA可作為診斷和預測多種疾病預后的新型生物標志物[9]。有研究發現，STEMI患者外周血中6個LncRNAs顯著高于非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者，可用于鑒別STEMI和NSTEMI[10]。Cai等[4]發現，LncRNA CoroMarker是冠心病的最佳候選生物標志物，且獨立于已知的冠心病危險因素和其他心血管疾病。功能富集分析表明，CoroMarker與炎癥呈負相關的基因聚集在一起。本研究發現CoroMarker在STEMI中表達較非疾病人群明顯下降，對診斷STEMI同樣具有良好的價值，且CoroMarker與血漿MCP-1濃度具有顯著負相關性。MCP-1是一種通過與CC趨化因子受體2（CCR2）結合來調節單核細胞趨化性和T淋巴細胞分化的趨化因子，在炎癥性疾病、動脈粥樣硬化和癌癥的發病機制中起關鍵作用[11]。有學者對STEMI后的患者的單核細胞亞群進行了定量分析，發現循環中的非經典單核細胞與心肌壞死之間存在正相關[12]。我們猜測CoroMarker可能通過調節MCP-1及相關信號通路參與心肌炎癥過程，但具體信號通路仍需進一步研究證實。

尋找良好的預后生物指標也是心血管領域的研究熱點，個別LncRNA已被證實在AMI中具有一定的預后預測價值，如ANRIL、KCNQ1OT1和心肌梗死相關轉錄本可預測AMI后4個月是否會發生左心室心臟功能受損[13]。我們研究發現，CoroMarker可預測STEMI患者院內主要不良心血管事件的發生，是院內MACE的保護因子，但對出院后長期MACE無預測價值。這可能是因為AMI急性期的病理生理是影響短期預后的重要因素，而長期預后還受藥物治療、生活方式和其他心血管危險因素的控制情況影響。一些研究者通過細胞或動物模型的研究發現，上調或下調關鍵LncRNA的表達水平可能是治療AMI的一種治療策略。在大鼠AMI模型中，HOTAIR過表達可抑制炎癥和心肌細胞凋亡，并減少心肌梗死面積[14]。對于CoroMarker能否作為一種治療AMI的干預靶點，仍需深入研究。

本研究局限性在于：僅在STEMI患者血液循環PBMC中檢測CoroMarker的表達水平，未在動物或細胞層面深入分析上下游信號通路，難以闡明CoroMarker的具體分子機制；樣本量較少，且為單中心研究，需更大的樣本量確保其作為生物標志物的診斷潛力?？傊?，我們在人體中初步證實LncRNA CoroMarker可作為STEMI的診斷生物標志物，具有預測STEMI患者住院期間發生主要不良心血管事件的作用，并且可能通過調控相關炎性因子參與STEMI的發病過程。后期有必要進一步深入分析CoroMarker的具體生物機制，為心肌梗死的治療提供更多理論依據。