雞源血清4型禽腺病毒的分離鑒定與組織滅活苗免疫效果研究

李 婧，葛春艷，李佳暖

（1.山東畜牧獸醫職業學院，濰坊 261061；2.威海市文登區畜牧獸醫技術服務中心，威海 264400）

禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是雞、鴨、鵝等禽類體內的常見病毒。根據群特異性抗原的不同可將FAV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個群，Ⅰ群禽腺病毒主要引起雞的心包積液綜合征和包涵體肝炎；Ⅱ群禽腺病毒主要引起火雞出血性腸炎和雞脾臟腫大；Ⅲ群禽腺病毒主要引起雞的產蛋下降綜合征。其中Ⅰ群又可分為A、B、C、D、E 5個種和12個血清型[1]。我國流行的血清型主要為FAV-11、FAV-4、FAV-8a、FAV-8b[2]。

心包積液綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）主要是由FAV-4引起的一種原發性傳染病，其典型特征為3～5周齡肉雞突然死亡，并伴有心包積液和肝炎，死亡率可達20%～60%[3-4]。該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區首次發生（安卡拉?。?，隨后在多個國家呈暴發性流行。我國自2013年起出現該病的報道，2015年6月份以來，該病在我國大面積流行，主要集中在山東、河南、河北、遼寧、安徽、吉林等地區[5]。除肉雞外，也可見于雜交雞、麻雞、種雞和蛋雞，肉鴨也有發生。本病既可垂直傳播，又可水平傳播，雞感染后可終身帶毒，并間歇性排毒，該病是當前國內雞養殖戶最為關注的疫病之一。

2018年9月山東某雞場32日齡肉雞發病，臨床初步診斷為心包積液綜合征，本研究從臨床發病雞的肝臟、脾臟等病料組織中分離到1株病毒，并對分離株進行鑒定、分析，最后確診此次病原為血清4型禽腺病毒，為控制病情還試驗了肝組織滅活苗的預防與控制效果，本研究為該病的防控提供了一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集、實驗動物與主要試驗材料 病料取自山東某雞場送檢的疑似禽腺病毒感染的白羽肉雞。SPF雞胚與SPF雞均購自山東省農業科學院濟南家禽研究所。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、PCR通用rTaq試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、DL2000 DNA Marker等購自天根生化科技（北京）有限公司；克隆用宿主菌E.coliDH5α和載體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 病料PCR檢測 根據GenBank已發表的FAV基因序列（EU177544），針對其Hexon基因設計并合成1對特異性引物（F：5'-CTTCCCCAAT CCCAACCAG-3'，R：5'-TAGTGATGMCGSGA CATCAT-3'），以病雞肝臟、脾臟等組織樣品所提取DNA為模板，進行PCR檢測，預期擴增長度500 bp。

1.3 病毒的分離與傳代 取病變明顯的肝組織約2.0 g，置于無菌研磨器中，研磨過程中加入5 mL PBS，反復凍融3次，4℃、3000 ×g離心15 min，上清液用0.22 μm的細菌濾器過濾，經卵黃囊接種于9日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，37℃孵育，棄掉24 h以內死亡的雞胚，無菌收集72 ～120 h死亡的雞胚尿囊液及120 h未死亡雞胚尿囊液，按照上述方法盲傳3代，-80℃保存備用，觀察雞胚病理變化。按常規方法對第3代雞胚尿囊液分離病毒進行雞紅細胞凝集試驗，按常規方法進行雞胚半數致死量（50% egg lethal dose,ELD50）測定。

1.4 分離株序列鑒定和遺傳進化分析 利用PCR或RTPCR方法進行IBDV、CIAV、REV的檢測[7-8]，排除混合感染情況。按1.2方法對分離株DNA進行PCR擴增，回收擴增產物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。將測得的Hexon基因序列與GenBank數據庫進行比對，并利用MEGA6.0生物學軟件進行遺傳進化分析，構建遺傳進化樹。

1.5 動物回歸試驗 將10只7日齡SPF雛雞平均分為兩組，實驗組肌肉注射分離毒株第三代雞胚尿囊液0.2 mL/只（104.5ELD50/0.2 mL），對照組注射等量的滅菌生理鹽水，每日觀察并記錄各組雞的臨床表現以及發病死亡情況，解剖死亡雞，觀察病理變化。

1.6 免疫保護試驗

1.6.1 組織滅活苗制備 無菌采集病死雞肝臟，按1∶5比例加入滅菌生理鹽水，高速勻漿后過濾，濾液中加入終濃度3 mL/L的甲醛溶液，37℃、24 h震蕩滅活，無菌檢驗合格后，接種10只7日齡雞，2 mL/只，觀察5 d后接種雞均健活為合格。加入等量生理鹽水混勻后分裝備用。

1.6.2 抗體效價檢測與疫苗免疫攻毒保護試驗 將40只7日齡SPF雛雞平均分成2組，實驗組腿部肌肉注射組織滅活疫苗0.2 mL/只，對照組注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只，在免疫后第4、7、14、21 d各取5只實驗雞、對照雞翅靜脈采血0.5 mL，分離血清，以10倍濃縮的分離株滅活抗原為檢測抗原，通過瓊擴試驗檢測抗體；采血后實驗組肌肉注射分離病毒0.2 mL/只（104.5ELD50/0.2 mL），對照組注射等量滅菌生理鹽水，觀察并記錄死亡情況。

1.6.3 緊急接種保護試驗 自采集病料的發病雞群（25日齡，發病5 d）隨機抽取200只尚未發病雞，平均分為2組，分別隔離飼養3 d，兩組各有部分雞只表現精神沉郁、食欲減退等癥狀，其中實驗組通過胸部肌肉注射緊急接種組織滅活疫苗1 mL/只，對照組接種等量生理鹽水，兩組同時給予電解多維及維生素C等抗應激藥物，觀察并記錄死亡情況。

2 結果

2.1 病料PCR檢測結果 對病變組織進行血清4型FAdVHexon基因PCR擴增，結果顯示在肝臟、脾臟組織中均擴增出與預期大小相符的特異性條帶（圖1）。

圖1 FAV-4目的基因PCR擴增Fig.1 The PCR product of FAV-4 target gene

2.2 病毒分離傳代結果 接種雞胚均在接種后72～120 h內死亡，死亡雞胚表現發育受阻，全身充血、出血，肝臟腫大、質地變脆。常規方法檢測尿囊液不能凝集雞、鴨紅細胞。按Reed-Muench法計算,該分離毒株對雞胚的ELD50為10-4.5/0.2 mL。

2.3Hexon基因同源性分析 將測序得到的Hexon基因序列與GenBank上登錄的12個血清型進行同源性比對和系統進化分析，結果發現分離毒株與FAdV-4參考毒株同源性為99%，與近年來國內流行的FAV-4毒株親緣關系較近，處于一個分支上，與FAdV 1～3、5～11血清型參考毒株親緣關系較遠（圖2）。以上試驗結果表明該分離株為FAdV-4血清型，將其命名為FAdV-4血清型LH株。

圖2 分離毒株（LH）與參考株的Hexon基因遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the Hexon gene of the isolated virus (LH) and the reference strain

圖3 兩組死亡情況對照Fig.3 Comparison of mortality between the two groups

2.4 動物回歸試驗結果 人工接種雛雞后，第2 d開始出現死亡，剖檢可見有心包積液，肝臟出血腫大，腎臟腫大出血，與臨床感染雞癥狀病變相似，并可再次分離到該病毒。對照組無明顯變化。表明雞胚接種獲得的分離株（LH株）即為引起臨床發病的病原。

2.5 抗體效價檢測與疫苗免疫攻毒保護試驗結果 抗體效價檢測結果顯示，免疫后14 d才可檢測到瓊擴抗體，至21 d抗體陽性率達100%。但攻毒保護試驗結果顯示，免疫后4 d即可產生一定保護（25%），隨后保護率逐漸上升，免疫后14 d可產生較強保護（80%），免疫后21 d攻毒，免疫組雞只無發病、死亡，表現100%保護，表明組織滅活疫苗對于預防本病具有較好的效果，在免疫后14 d即可產生足夠保護（80%），21 d可產生完全保護；而且還可產生早期保護，在抗體能檢測到甚至產生之前，疫苗即可提供一定保護作用（表1）。以上結果提示在FAdV-4感染發病初期可通過組織滅活疫苗緊急控制本病。

表1 免疫后抗體陽性率與攻毒保護試驗結果Table 1 The positive rate of antibody and the results of protective test

2.6 緊急接種保護結果 實驗組緊急免疫后統計死亡數顯示，免疫當天死亡數高于對照組，此后一直低于對照組，且3 d后呈現明顯下降趨勢，6 d左右病情得到完全控制；對照組死亡數量持續上升（圖4）。分析該結果表明，在發病初期（有癥狀，但暫無死亡）緊急接種組織滅活疫苗，免疫初期由于應激反應導致發病數與死亡數有一定上升后免疫效果持續增強，6 d左右可完全控制本病。

3 討論

自2015年6月份以來，由腺病毒引起的心包積液綜合征在我國多個省份大面積暴發并呈區域性流行，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失。FAdV-4是雞HHS的主要病原[4-6]，但也有報道稱禽腺病毒的1、2、4和8型均能引起心包積液綜合征，且近年來山東等地的優勢血清型以8b為主[9]。本研究中分離株LH為FAdV-Ⅰ群C種、血清4型，且同源性與近年來國內報道的毒株極為相似，表明LH株仍為國內普通流行株。

HHS多在發病3～5 d達到死亡高峰，并持續7～10 d，可造成較大損失，目前本病防治困難，國內尚無商品化疫苗用于預防[10-11,15]；因病雞肝臟受損，肝功能紊亂，常規的藥物治療效果不佳[13]；據報道，卵黃抗體治療具有較好的療效[12-13]，但該病周期長，有時能持續1個月以上，卵黃抗體作用多為7～10 d，不能完全控制該病[9]。

本實驗發現組織滅活疫苗對于預防與控制該病均具有良好的效果，免疫后4 d即可產生保護，21 d即可產生完全保護，可用于該病的預防接種；對發病雞群進行緊急接種，可在6 d左右完全控制該病。