Ⅰ群禽腺病毒（4型）Fiber-2蛋白亞單位疫苗與全病毒滅活疫苗的免疫效果比較

杜東穎，霍環艷，田 輝，王璐璐，王孟月，洪素梅，高曉靜，田克恭

（國家獸用藥品工程技術研究中心，洛陽 471000）

雞肝炎-心包積液綜合征（hepatitishydropericardium syndrome,HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的高致病性傳染病[1]，近幾年來，該病在我國廣泛流行，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失，目前已成為危害養禽業的主要疫病之一[2-4]。HHS可水平和垂直傳播，不同品種的雞均可感染發病[5]。

FAdV-4是無囊膜的雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，包含3種主要結構蛋白[6-7]，分別為六鄰體（Hexon）蛋白、五鄰體（Penton）基座、纖突蛋白（Fiber）。FAdV-4 Fiber具有兩個獨立的Fiber編碼基因Fiber-1和Fiber-2[8]，Fiber-2蛋白具有誘導中和抗體產生的能力，是具有保護性的免疫原[9]?，F有研究結果顯示，使用不同表達系統獲得的重組Fiber-2蛋白均具有良好的免疫原性，可作為亞單位疫苗候選蛋白進行疫苗研制開發[9-11]。

目前對于禽腺病毒的防控主要以全病毒滅活疫苗為主，研究證實，全病毒滅活疫苗具有較好的免疫效果[12-14]。但全病毒滅活苗需借助雞胚或細胞增殖病毒，制備工藝繁瑣、生產成本較高，且活毒操作存在生物安全風險。因此，安全、有效、價格低廉的亞單位疫苗，在臨床疫病防控方面具有良好的開發和應用前景。

本研究利用原核表達系統對Fiber-2蛋白進行表達、純化，將純化后的Fiber-2蛋白制備不同抗原含量的亞單位疫苗，同時制備不同抗原含量的全病毒滅活疫苗，采用超低免疫劑量對全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果進行比較研究，為亞單位疫苗研制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗動物與試劑 SPF雞購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG）誘導劑、預染蛋白Marker均購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgY二抗購自北京百奧萊博科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購自美國General Electric Company；DMEM培養基、胎牛血清均購自Gibco；β-丙內酯購自美國Sigma公司；商品化禽腺病毒I群（FADV-I）抗體ELISA試劑盒購自荷蘭BioChek。

1.2 質粒、毒株和細胞 pET-30a-Fiber-2重組質粒由國家獸用藥品工程技術研究中心構建、鑒定與保存；Ⅰ群FAdV-4 FAV-HN株C3代毒種由國家獸用藥品工程技術研究中心分離、鑒定與保存；LMH細胞由國家獸用藥品工程技術研究中心保存；Ⅰ群FAdV-4陽性血清由國家獸用藥品工程技術研究中心鑒定、制備與保存。

1.3 Fiber-2蛋白的表達與純化 將重組質粒pET-30a-Fiber-2，轉化入大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落至LB液體培養基中（硫酸卡那霉素的質量濃度為50 μg/mL），37℃振蕩培養過夜；將菌液按照1∶100的體積比加至LB液體培養基（硫酸卡那霉素的質量濃度為50 μg/mL）中；37℃繼續培養至菌液OD600值為0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進行誘導8 h。對誘導后的菌體進行超聲裂解，取離心后上清液加入終濃度為0.01 mol/L的咪唑，利用Ni SepharoseTM6 Fast Flow鎳柱進行層析純化，收集流穿、洗脫液和洗脫樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，PBS透析除去咪唑并過濾除菌。使用Ⅰ群4型禽腺病毒陽性血清進行瓊脂擴散試驗，測定Fiber-2蛋白液的AGP效價。

1.4 Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液制備及滅活

1.4.1 病毒液制備及病毒含量測定 ?、袢呵菹俨《荆?型）FAV-HN株C3代毒種，按照0.1%的體積比接種至長成單層的LMH細胞，37℃、5% CO2培養箱中培養。每6～8 h觀察1次細胞病變，待80%以上細胞出現病變時收獲。凍融2次，取樣測定病毒含量，其余置-20℃以下凍結保存。

1.4.2 病毒液滅活及檢驗 取出凍結保存的Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液，融化后，加入2%的β-丙內酯溶液，使β-丙內酯的終濃度為0.1%，搖勻后，置2℃～8℃條件下滅活16 h，待病毒液溫度降至恒溫時開始計時，16 h后取出置37℃水解2 h。水解后取樣進行無菌檢驗和滅活檢驗。

1.5 不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗免疫效果比較

1.5.1 疫苗制備 為評價不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗對SPF雞的免疫效力，本研究將純化的Fiber-2蛋白液分別稀釋至AGP效價為1∶16、1∶8、1∶4，將滅活檢驗合格的病毒液按照滅活前病毒含量稀釋至病毒含量分別為107.0TCID50/0.1mL、106.5TCID50/0.1mL和106.0TCID50/0.1mL，分別按照水相∶油相（1∶2）乳化制備6種不同抗原含量的亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗進行免疫效果比較。

1.5.2 攻毒保護試驗 選取60只健康的21日齡SPF雞，隨機分為6個組，每組10只，分別經腿部肌肉接種上述6種疫苗，20 μL/只，另設5只SPF雞接種滅菌生理鹽水作為攻毒對照、5只不免疫作為空白對照，分組情況詳見表1。免疫21 d后，將所有疫苗免疫組和攻毒對照組的雞只，經腿部肌肉注射Ⅰ群FAdV-4 FAV-HN株病毒液，每只0.5 mL（含106.0TCID50），觀察7 d，記錄免疫組和攻毒對照組雞的發病和死亡情況，死亡雞立即剖檢，觀察大體剖檢病變并取肝臟進行組織病理學觀察和免疫組化，至攻毒后7 d，所有存活雞剖檢，觀察大體剖檢病變并取肝臟進行組織病理學觀察和免疫組化。

表1 試驗分組Table 1 Test groups

1.5.3 泄殖腔拭子排毒 攻毒保護試驗SPF雞于攻毒后3、5、7 d采集每只雞的泄殖腔拭子進行PCR檢測排毒，提取泄殖腔拭子核酸，參考文獻[15]報道引物PCR檢測擴增HexonL1基因片段。所使用的上、下游引物分別為HexonL1-F和HexonL1-R，目的片段約為900 bp，引物序列HexonL1-F為：5'-CAARTTCAGRCAGACGGT-3'，引物HexonL1-R為：5'-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3'。

2 結果

2.1 Fiber-2蛋白的表達與純化 誘導重組大腸桿菌表達Ⅰ群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白，并利用Ni Sepharose 6 Fast Flow填料進行親和層析，未純化的蛋白和不同時間點純化收集的蛋白、純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳鑒定，結果可知，純化后的蛋白在55～70 kDa處可見到明顯的目的條帶，純度可達80%以上（圖1）。測定純化后Fiber-2蛋白液的AGP效價為1∶64。

圖1 Fiber-2蛋白純化過程SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purification process of Fiber-2 protein

2.2 Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液制備及檢驗 制備C4代病毒液，并取樣測定其病毒含量為107.4TCID50/0.1mL。

2.3 滅活后病毒液的滅活檢驗及無菌檢驗 對滅活后的病毒液進行無菌檢驗和滅活檢驗，無菌檢驗結果顯示，接種后7 d，TG小管、GA斜面、TSB小管均無菌生長，無菌檢驗合格。滅活后病毒液接種LMH細胞進行滅活檢驗，盲傳2代，LMH細胞均未產生細胞病變，滅活檢驗合格。

2.4 攻毒保護 攻毒保護試驗結果顯示，G組SPF雞于攻毒后第2～3 d發病，出現精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動、嗜睡等臨床癥狀，出現臨床癥狀后1～2 d死亡，死亡雞剖檢可見心包積液、肝臟腫大、出血等病理變化，至攻毒后第7 d，4/5死亡、5/5發病。A、B、D組免疫雞攻毒后全部健活，未出現任何臨床癥狀，攻毒后7 d剖檢，均無異常。C、E組免疫雞均1/10出現羽毛蓬亂、不愿走動等臨床癥狀，攻毒后7 d剖檢，1/10～2/10免疫雞出現少量心包積液或肝臟腫大等病變，而F組免疫雞攻毒后7 d內5/10死亡、9/10發病，攻毒后7 d剖檢，9/10免疫雞出現心包積液或肝臟腫大、出血等病變。結果詳見表2和圖2。

圖2 不同抗原含量疫苗組的剖檢病變結果Fig.2 Anatomy results of different vaccine groups

表2 不同抗原含量疫苗組的攻毒保護結果Table 2 Challenge protection results of different vaccine groups

2.5 肝臟組織病理學觀察和免疫組化 攻毒后7 d內，立即剖檢死亡雞，取肝組織進行HE染色和免疫組化，至攻毒后7 d，所有存活雞剖檢取肝臟組織進行HE染色和免疫組化檢測，結果可知，A、B、D組免疫雞肝組織HE染色未見明顯病變，免疫組化均為陰性；C、E組免疫雞1/10～2/10可見不同程度的肝細胞脂肪變性、壞死，核內包涵體及局灶性淤血出血，1/10免疫組化陽性；F組免疫雞9/10免疫雞可見不同程度的肝細胞脂肪變性、壞死，大量核內包涵體及大面積淤血出血，8/10免疫組化陽性。G組免疫雞均可見大量肝細胞脂肪變性、壞死，大量核內包涵體及大面積淤血出血，且免疫組化均為陽性（圖3～4，表3）。

圖3 不同抗原含量疫苗組的HE染色結果Fig.3 HE staining results of different vaccine groups

圖4 不同抗原含量疫苗組的免疫組化染色結果Fig.4 Immunohistochemical results of different vaccine groups

表3 不同抗原含量疫苗組的免疫組化染色結果Table 3 Immunohistochemical results of different vaccine groups

2.6 泄殖腔拭子排毒 于攻毒后3、5、7 d分別采集每組雞泄殖腔拭子，采用PCR測定雞泄殖腔拭子排毒情況，結果可知，A、B和D組攻毒后不同時間均未檢測到排毒，而C、E、F組均檢測到不同程度的排毒，綜合分析，A、B和D組免疫效果相當，C略優于E組，F組免疫效果最差（表4）。

表4 不同抗原含量疫苗組的泄殖腔拭子排毒結果Table4 Cloacal swab detoxification results of different vaccine groups

3 討論

禽腺病毒是一種在全世界范圍內廣泛流行的家禽和野禽常見的傳染病病原。其分為3個亞群，Ⅰ亞群禽腺病毒分為A、B、C、D、E 5個種，12個血清型，其中雞肝炎-心包積液綜合征是由血清4型引起。該病首次在巴基斯坦的安卡拉地區發生，隨后陸續在韓國、印度、美國等地區流行[16]。該病于2014年在我國零星發生，但2015年起，在我國多地呈暴發式傳播，致死率高達50%，給我國養禽業造成巨大經濟損失，疫苗接種是預防和控制該病傳播的主要手段之一。

在HHS暴發初期，有研究報道將感染雞肝臟組織研磨、滅活，制備組織滅活疫苗用于預防該病傳播具有一定的效果，但組織苗存在制備工藝復雜、滅活不徹底等問題；為了更好的防控該病的傳播，采用細胞培養和SPF雞胚制備滅活苗成為更好的選擇，但是仍存在部分毒株在細胞和雞胚上增殖效果差，生產成本高等諸多問題。有研究報道，針對HHS的預防與治療，與滅活苗相比，通過重組蛋白制備的亞單位疫苗可以為該病提供更好的防控[17-18]，而且亞單位疫苗生產工藝抗原生產成本低、不存在滅活不徹底、抗原含量不易達標、活毒操作存在生物安全風險等不足，因此重組蛋白亞單位疫苗有望成為繼滅活苗后更理想的新型疫苗。

王晨等[19-20]利用桿狀病毒表達系統表達Fiber-2蛋白制備FAdV-4亞單位疫苗，該疫苗可為免疫雞提供理想的免疫攻毒保護。但真核表達系統工藝復雜，成本較高。本研究選用大腸桿菌表達系統，獲得可溶性的AGP效價不低于1∶64的Fiber-2蛋白，工藝簡單，生產成本低，制備的亞單位疫苗免疫攻毒保護效果確實，適合進行規?；a。同時，本研究發現，使用荷蘭BioChek商品化的禽腺病毒Ⅰ群（FADV-I）抗體ELISA試劑盒對Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒疫苗免疫血清進行抗體檢測時，前者血清抗體值顯著低于后者。對造成這種現象的原因進行分析，ELISA試劑盒使用全病毒為包被抗原，FAdV-4病毒粒子中結構蛋白Hexon占比較高，而Fiber-2蛋白極低，因此使用ELISA試劑盒測得的Fiber-2抗體結果較低甚至陰性。因此不能使用全病毒為包被抗原的ELISA試劑盒評價Fiber-2亞單位疫苗免疫血清的抗體效價[21]。

本研究制備不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗，在超低免疫劑量情況下，對全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果進行全面比較研究，免疫攻毒保護試驗結果顯示，Fiber-2蛋白具有良好的免疫原性，抗原含量AGP效價不低于1∶4，與全病毒滅活疫苗抗原含量為106.5TCID50/0.1mL免疫效力相當，可用于疫苗研制開發。