靶向B細胞的口蹄疫GHloop多肽抗原的制備及免疫效力鑒定

侯立婷，張媛媛,4，于曉明，杜露平，張元鵬，程海衛，喬緒穩，李 丁，鄭其升，陳 瑾

（1.江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所，南京 210014；2.江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014；3.獸用生物制品（泰州）國泰技術創新中心，泰州 225300；4.省部共建國家重點實驗室培育基地—江蘇省食品質量安全重點實驗室，南京 210014）

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是危害世界各國養殖業最嚴重的疾病之一，其病原是口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）。免疫接種是預防和控制口蹄疫疾病的有效方法[1-2]。在我國，FMD屬于國家強制免疫類疾病，目前商品化的疫苗有FMD滅活疫苗和合成肽疫苗兩種。FMDV由VP1、VP2、VP3、VP4 4種衣殼結構蛋白構成，VP1結構蛋白位于病毒粒子表面，其中第140-160位氨基酸處的GHloop是最主要的保護性抗原位點，可誘導感染動物產生中和抗體[3-5]。眾多學者將該表位作為研究重點，證實了其具有良好的免疫原性。

葡萄球菌A蛋白人工合成類似物的二聚體（DD,a dimer of an Ig-binding fragment D ofStaphylococcus aureusprotein A）是一種免疫球蛋白（Ig）結合片段，能夠靶向B細胞受體，促進B細胞的活化和增殖[6]。B細胞作為體液免疫的重要組成部分，通過其表面分布的B細胞受體（B cell receptor,BCR）識別外界抗原，是機體產生保護性抗體及免疫記憶的關鍵步驟[7]。B細胞是介導抗體應答的效應性細胞，可分化為分泌高親和力抗體的漿細胞及記憶性B細胞。漿細胞產生的抗體可幫助清除病原體，記憶性B細胞可在機體再次遭遇相同病原體時快速活化、高速增殖，介導高滴度、高親合力的抗體應答，快速、高效、高度特異性地清除病原體[8-9]。

本研究利用基因工程技術構建了一種融合蛋白GHloop-DD，這種融合蛋白是在GHloop的C末端連接兩個Ig結合域（DD），將融合蛋白可溶表達后利用鎳柱進行純化，制備疫苗免疫小鼠，評價其免疫效力，這為FMDV亞單位疫苗的研究提供了參考依據。

1 材料方法

1.1 材料 原核表達載體pET32a由動物免疫工程研究所免疫技術研究室保存。質粒提取、膠回收試劑盒購自AxyGEN公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、PCR試劑、pMD-19-T vector、DNA Marker等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α、BL21感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白質相對分子量標準、BCA試劑盒購自Thermo公司；PVDF膜購自Millipore公司；FMDV多肽陽性血清由本實驗室制備，系用商品化的中牧實業股份有限公司生產的FMDV合成肽疫苗多次免疫小鼠獲得；HIS單克隆抗體、DAB顯色液、HRP標記的羊抗鼠IgG、MTT購自南京生興生物科技有限公司；anti-B220 APC、anti-CD138 PE購自Milrenyi Biotec；5周齡的ICR小鼠購自揚州大學比較醫學中心；豬口蹄疫O型合成肽疫苗（批號1911001）由動物免疫工程研究所提供；豬口蹄疫病毒O型VP1合成肽ELISA抗體檢測試劑盒（批號200501）購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；206佐劑購自Seppic公司；IFN-γ和IL-4細胞因子檢測試劑盒購自南京奧青生物公司。

1.2 目的基因設計與合成 根據口蹄疫GHloop（GenBank登錄號：AEH05465.1；序列為VYNGN CKYAGGSLPNVRGDLQVLAQKAARPLPTSFNYG AIK）和葡萄球菌A蛋白人工合成類似物的二聚體（GenBank登錄號：CAC7571947.1；序列為KTNST KISKVPSMKFTCRTMKNSAMALSNLKTIRRKAPT SWVKRKNMNHRPRKQTLNRMNLTKISNRRFTKSI CRIMKNSVMASSKAKTIRLRVRTFWAKRKNTNLR LRKVEEVLEEVVAEVANSAAATPATRRPRAWVN FWMNTRARLNVKSSAAIRATSIPTTVLRTS）的基因序列設計融合蛋白GHloop-DD，并通過全基因合成的方式合成。為提高該蛋白在大腸桿菌中的表達量并促進其可溶性表達，按照大腸桿菌偏好密碼子對目的基因的核苷酸序列優化后合成，在序列兩端添加NdeⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，并克隆入pUC57載體。

1.3 重組質粒的構建 將基因片段GHloop-DD從pUC57載體上通過NdeⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點切下，克隆到原核表達載體pET32a，構建重組表達質粒，將其命名為pET32a-GHloop-DD。

1.4 重組菌的構建與表達 將重組質粒pET32a-GHloop-DD轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取單菌落，得到重組菌pET32a-GHloop-DD/BL21。將空質粒pET32a按照相同的方法轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，得到對照菌株pET32a/BL21。

挑取重組菌pET32a-GHloop-DD/BL21與pET32a/BL21單菌落，接種5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，再按1∶100比例轉接含新的氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養基，37℃、220 rpm振蕩培養1.5～2 h（OD600至0.5～1.0），加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，18℃誘導24 h，收獲細菌。

1.5 目的蛋白可溶性鑒定 取2 mL誘導后菌液，離心收集菌體，用1 mL PBS緩沖液重懸，在冰水浴中超聲波破碎細胞。破碎后離心收集全部上清液，保留備用，沉淀用1 mL PBS緩沖液重懸。將完整的誘導菌體以及超聲波破碎后的上清液、沉淀進行SDSPAGE電泳，檢測融合蛋白的表達及可溶性。

1.6 Western blot鑒定 重組蛋白SDS-PAGE電泳后再轉印到PVDF膜上，37℃、5% BSA封閉孵育1 h，TBST洗滌2次，加1∶2000稀釋的HIS單克隆抗體/FMDV多肽陽性血清孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，加1∶5000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，TBST洗滌5次，5 min/次，DAB顯色后觀察特異性條帶。

1.7 疫苗制備及免疫原性鑒定

1.7.1 蛋白定量及小鼠免疫 鎳柱純化后的蛋白用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按照2.5 μg/只的劑量與206乳化制備疫苗，免疫5周齡的ICR小鼠，每組8只，頸部皮下多點注射100 μL/只，同時設置空白和合成肽疫苗（生產廠家：中牧實業股份有限公司，批號1911001）對照組。合成肽疫苗按照說明書劑量，每只免疫2.5 μg/100 μL。免疫后28 d采集血液進行間接ELISA抗體檢測。

1.7.2 血清IgG抗體檢測 按照免疫程序采集小鼠血清，按照豬口蹄疫病毒O型VP1合成肽ELISA抗體檢測試劑盒說明書測定其血清抗體。

1.7.3 淋巴結B細胞及相關轉錄因子檢測 免疫后28 d，分離下頜淋巴結，制備單細胞懸液。調整細胞密度為1×106個/管，加入抗體anti-B220 APC，置于4℃，染色30 min，熒光洗液洗滌兩次，加入固定液，進行流式細胞儀檢測。

取相同質量的淋巴結，用TRIzol裂解法提取RNA，利用一步反轉試劑盒獲得cDNA。根據GenBank中公布的相關序列設計引物，參考文獻[10]的方法利用熒光定量PCR檢測Blimp1、IRF4、XBP1、Pax5的基因水平。

1.7.4 小鼠骨髓漿細胞檢測 免疫后28 d，分離股骨，收集骨髓，制備單細胞懸液。調整細胞密度為1×106個/管，加入抗體anti-B220 APC、anti-CD138 PE，置于4℃，染色30 min，熒光洗液洗滌兩次，加入固定液，進行流式細胞儀檢測。

1.7.5 IFN-γ和IL-4細胞因子檢測 無菌采取小鼠脾臟，分離淋巴細胞，細胞用含雙抗的RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至5×106個/mL，96孔板中，每孔100 μL，每個樣品4個重復孔，加入終濃度為2 μg/mL純化的O型FMD抗原刺激，培養48 h后，收集上清液，用IFN-γ和IL-4試劑盒檢測（操作見說明書）相應的細胞因子含量。

2 結果

2.1 含目的基因的質粒的構建 將基因片段GHloop-DD用NdeⅠ和XhoⅠ酶切回收后，克隆到原核表達載體pET32a，構建重組表達質粒pET32a-GHloop-DD，并進行酶切鑒定。酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測可得到690 bp左右的目的片段（圖略），與預期設計的目的基因片段大小一致。

2.2 重組蛋白的表達及可溶性鑒定 將鑒定正確的重組表達質粒轉化BL21感受態細胞，涂布含有氨芐氯霉素的LB平板，然后挑取單個菌落培養。取菌液接種到含有氨芐氯霉素的LB液體培養基中，37℃培養到細菌濃度達到OD600為0.6～1.0加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，誘導20 h后，收集菌液，離心去除培養基，用PBS重懸菌體后經高壓破碎儀破碎菌體，用SDS-PAGE檢測表達產物（圖1），重組蛋白分子量約為26 kDa，并以可溶性形式存在于破碎菌體的上清液中。

圖1 重組蛋白表達及可溶性分析Fig.1 Expression and solubility identification of the recombinant protein with SDS-PAGE

2.3 重組蛋白表達產物Western blot鑒定 經SDSPAGE電泳后，轉印至PVDF膜，用HIS單克隆抗體對表達產物進行Western blot鑒定，結果可知，PVDF膜上的條帶與SDS-PAGE表達的蛋白條帶大小一致，表明表達的重組蛋白可被特異性的HIS單克隆抗體和FMDV多肽陽性血清所識別（圖2）。

圖2 重組蛋白Western blot鑒定結果Fig.2 Western blot analysis of recombinant protein

2.4 小鼠血清抗體檢測 利用口蹄疫病毒O型VP1合成肽ELISA抗體檢測試劑盒檢測其抗體水平。結果可知，小鼠免疫后28 d，合成肽疫苗免疫組的平均抗體水平為2.27±0.1065，GHloop-DD疫苗免疫組的平均抗體水平為2.131±0.1018，統計學顯示，兩個疫苗免疫組的抗體水平無顯著性差異（P＞0.05）（圖3）。實驗結果表明GHloop-DD能夠誘導小鼠機體產生與商品化合成肽疫苗類似的體液免疫反應。

圖3 疫苗免后FMDV VP1結構蛋白抗體檢測Fig.3 Detection of antibodies against FMDV VP1 structural protein in mice by ELISA

2.5 小鼠淋巴結相關檢測結果 采用流式和熒光定量的方法檢測B細胞的數量和相關轉錄因子水平。結果可知，GHloop-DD疫苗免疫組小鼠在免疫后28 d淋巴結中B細胞的數量顯著高于合成肽疫苗免疫組，統計分析顯示與合成肽疫苗引發的B淋巴細胞反應差異極顯著（P＜0.001）（圖4A）。免疫后28 d，利用熒光定量的方法檢測下頜淋巴結相關轉錄因子的表達水平。結果可知，GHloop-DD免疫組小鼠能夠上調轉錄因子Blimp1、XBP1、IRF4，下調轉錄因子Pax5。統計學分析顯示，GHloop-DD免疫組與合成肽疫苗免疫組相關轉錄因子表達水平差異顯著（P＜0.05）（圖4B）。

圖4 小鼠免疫后28 d淋巴結B細胞及相關趨化因子水平檢測Fig.4 The levels of B cells and chemokines in lymph nodes of mice 28 days after immunization

2.6 小鼠免后相關B細胞檢測結果 免疫后28 d，利用流式檢測骨髓中長壽漿細胞（B220-CD138+）的占比。結果可知，GHloop-DD疫苗免疫組小鼠骨髓中長壽漿細胞的比例顯著高于合成肽疫苗免疫組（P＜0.001）（圖5）。實驗結果表明，GHloop-DD組可以誘導更高水平的長壽漿細胞數目。

圖5 小鼠免疫后28 dpi骨髓長壽漿細胞數目流式檢測結果Fig.5 Long-life plasma cell responses were measured at 28 dpi by flow cytometry

2.7 小鼠免后相關細胞因子檢測 收集脾臟淋巴細胞刺激后的上清液，利用試劑盒進行檢測。結果可知，GHloop-DD疫苗免疫組的兩種細胞因子水平顯著高于合成肽疫苗免疫組。在GHloop-DD疫苗免疫組中，IFN-γ含量為287.65±18.76 pg/mL，顯著高于合成肽疫苗免疫組的201.87±16.59 pg/mL（P＜0.01）；IL-4含量為41.87±3.56 pg/mL，顯著高于合成肽疫苗免疫組的35.02±1.98 pg/mL（P＜0.05）（圖6）。

圖6 免疫后28 dpi體外淋巴細胞增殖反應誘導的FMDV特異性細胞因子水平Fig.6 Cytokine concentrations after FMDV-specific lymphocyte responses in vitro at 28 dpi

3 討論

口蹄疫在我國被列為A類傳染病，因此該病防控十分關鍵[11]。目前商品化的合成肽疫苗和滅活疫苗具有良好的免疫效果，從疾病的凈化角度出發，多肽苗具有明顯的優勢。FMDV VP1結構蛋白中的141～160 aa和200～213 aa是FMDV的主要中和表位，具有較好的免疫效果[12-13]。商品化的合成肽疫苗也包含這兩個表位，然而商品化的合成肽疫苗主要通過化學合成的方法來制備，成本較高。本實驗利用廉價的大腸桿菌表達系統，進行靶向B細胞的多肽疫苗的研制，并使其在大腸桿菌實現可溶性表達。該方法制備的重組蛋白可溶性高、成本低、操作簡單，易于規?；a的。同等劑量蛋白免疫小鼠后的抗體水平能夠達到商品化合成肽疫苗的免疫水平。

口蹄疫疫苗免疫后，以體液免疫反應為主，抗體水平與攻毒保護具有直接的相關性[14]，因此提高疫苗免疫后的抗體水平，對口蹄疫的防控具有重要的現實意義。B細胞是機體特異性體液免疫反應中的主要免疫活性細胞，B淋巴細胞到漿細胞的終末分化，是機體能否產生獲得性免疫的關鍵步驟[15]。DD可與人類和多種哺乳動物IgG的Fc段結合，其本身也是一種B細胞絲裂原，可使多克隆B細胞活化和增殖[16]。本研究結果證明，與對照的合成肽疫苗免疫組相比，GHloop-DD疫苗免疫組小鼠的淋巴結中B細胞數量明顯增多，說明GHloop-DD能夠引發小鼠機體更強的體液免疫反應。B細胞轉化為漿細胞需要多種轉錄因子的相互作用。轉錄因子Blimp、XBP1、IRF4可誘導成熟B細胞發育為漿細胞，Pax5是B細胞特有的核反式作用因子。其中Blimp-1的表達，抑制了Pax-5的表達；Pax-5的表達使XBP-1表達升高；Blimp-1和XBP-1的表達促使成熟B淋巴細胞向漿細胞發育[17-19]。GHloop-DD疫苗免疫組小鼠能夠上調轉錄因子Blimp、XBP1、IRF4的表達水平，下調轉錄因子Pax5的表達水平，并且該疫苗免疫組骨髓中長壽漿細胞的數量顯著高于合成肽疫苗免疫組，說明GHloop-DD可促進高水平和長效體液免疫反應的發生。

提高機體的細胞免疫水平對于機體預防FMDV感染具有重要的意義[20]。體外淋巴細胞增殖試驗結果顯示，FMDV刺激后，GHloop-DD疫苗免疫組的Th1型（IFN-γ）和Th2型（IL-4）細胞因子均有明顯上調，說明GHloop-DD對機體的細胞免疫調節有一定的作用。

本研究利用大腸桿菌表達系統制備的可溶性重組蛋白GHloop-DD，制備疫苗免疫小鼠后，產生了高水平的體液免疫反應，這為FMD多肽疫苗的改進奠定了基礎，也為新型高效的亞單位疫苗研究提供了新的思路。