狂犬病、犬瘟熱和犬細小病毒病三聯滅活疫苗免疫效果評價

龔成燕，陳 杰，潘虹軍，羅國良，劉夢佳，胡 博，趙建軍

（1.中國農業科學院特產研究所 農業農村部經濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；3.西北農林科技大學，楊凌 712100；4.吉林農業大學中藥材學院，長春 130112；5.濟南海關，濟南 250200）

狂犬病是由彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus）的狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的急性中樞神經系統癥狀的人獸共患傳染病[1]。RABV可以感染幾乎所有溫血哺乳動物，對公眾健康具有重大威脅，狂犬病造成死亡人類中99%以上是由感染家養犬咬傷造成的，目前國內犬類狂犬病發病率仍在不斷上升[2]。犬瘟熱是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起的一種熱性、高度接觸性傳染病[3]。其自然宿主近些年來不斷擴增，包括犬科、鼬科、浣熊科等，甚至可能具有感染人的潛在風險[4-5]。CDV通過口鼻入侵宿主，并迅速在淋巴組織中復制，引起感染動物嚴重的免疫抑制[6]。犬細小病毒病是由細小病毒科（Parvoviridae）細小病毒屬（Parvovirus）的犬細小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起的一種急性、致死性傳染病[7]。犬細小病毒于1978年首次在澳大利亞和美國被發現，并在幾個月內傳播到世界各地[8]，CPV主要感染幼齡犬，短時間潛伏期后可引起嚴重的出血性胃腸炎癥狀，白細胞顯著減少為其臨床特征，并具有高傳染性和高致死率[9-10]，對養犬業造成了較大的損失。

狂犬病、犬瘟熱和犬細小病毒病嚴重影響著犬科動物的健康，目前解決這些問題最有效、直接的方法是疫苗接種?？袢』畈《疽呙缤ǔ１葴缁钜呙缒芨玫乇Ｗo犬[11]，但弱毒活疫苗可能因毒力返強而致病，并對免疫系統不健全或抑制狀態的犬造成潛在風險[12]，基因工程疫苗研制周期較長且不能完全控制流行毒株[13]。1911年，Liu等[14]首次通過活體腦內增殖RABV，并用石炭酸做滅活劑來制備滅活RABV疫苗，后期發現在體外BHK-21細胞上繁殖RABV具有同等效力；1923年，Franke等[15]用感染犬的腦組織滅活后首次研制出犬瘟熱滅活苗，但免疫犬不能有效抵抗CDV強毒株攻擊，后期發現在Vero細胞上培養的減毒CDV免疫原性要高于組織滅活疫苗[16]。1981年，Smith等[17]首次用CPV滅活疫苗免疫犬，免疫犬雖獲得攻毒保護，但不能完全阻止免疫犬排毒。隨著CDV受體信號淋巴細胞激活分子（signaling lymphocytic activation molecule,SLAM）的鑒定，穩定表達犬SLAM受體的細胞系，如Vero/DogSLAM（VDS）細胞，可用增殖CDV弱毒株和野毒株，增殖后病毒效價大大提高[18-20]，從而解決了CDV在體外細胞中增殖效價不高，制備滅活疫苗免疫原性低的問題。

在滅活疫苗中加入佐劑，可以延長疫苗的免疫保護期，促進機體特異免疫應答反應。目前，已研究的佐劑種類非常多，根據其來源可分為化合物和天然物兩大類[21]。市場上犬用疫苗佐劑多為合成的水佐劑和油佐劑，有研究結果顯示油佐劑疫苗相對于水佐劑疫苗，相同時間內，油佐劑疫苗免疫犬產生的抗體水平較低[22]。李敏等[13]制備的佐劑MONTANIDE GEL 01犬細小病毒滅活疫苗連續兩次免疫幼犬后，有效抗體可維持5個月；舒秀偉等[23]發現鋁膠（Al(OH)3）佐劑滅活疫苗（Flury株）免疫動物后能提高狂犬病病毒抗體效價，增強疫苗的免疫效果；張菲等[24]在制備貓用RABV滅活疫苗時采用特制的水包油佐劑，發現其可顯著提高疫苗的免疫效力。

目前，我國商品化聯苗中尚未有獲批的狂犬病-犬瘟熱-犬細小病毒病三聯疫苗上市。尤其是狂犬疫苗，目前多為單獨免疫[25-26]，導致在免疫預防過程中需要重復對動物進行免疫接種，不但增加了工作強度，也容易造成動物的應激反應。犬瘟熱疫苗多為弱毒疫苗，免疫原性雖高于滅活疫苗，但滅活疫苗相對活毒疫苗具有更好的安全性[27]。因此，本研究旨在通過比較不同佐劑對狂犬病-犬瘟熱-細小病毒病三聯滅活疫苗的免疫效果，從而開發出一種安全、有效的犬用三聯滅活疫苗，可同時針對狂犬病、犬瘟熱與細小病毒病三種犬病提供免疫保護。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和實驗動物 穩定表達犬SLAM受體的非洲獼猴腎細胞Vero/DogSLAM （VDS）、貓腎細胞（F81）和乳倉鼠腎細胞（BHK-21）由中國農業科學院特產研究所和黑龍江八一農墾大學保存。疫苗生產用CDV野毒株LN(10)1[28]、CPV強毒株JL(18)1-Beagle[29]、RABV弱毒株HEP-Flury[30]和病毒攻毒用CDV強毒SD(14)7株由國農業科學院特產研究所和黑龍江八一農墾大學保存鑒定[4]。實驗用6周齡比格犬57只，由中國農業科學院特產研究所比格犬養殖基地提供。

1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM細胞培養基購自南京WISENT生物技術公司；ADJ-801（W）佐劑由河南通商進出口有限公司惠贈，MONTANIDE GEL 02佐劑購自上海SEPPIC生物技術公司，Al(OH)3鋁鹽佐劑購自吉林正業生物制品有限公司；滅活劑β-丙內酯購自Ferak Berlin GmbH公司；狂犬病病毒抗體ELISA試劑盒為北京金諾百泰生物技術有限公司（獸藥生字010678829）產品；4%多聚甲醛購自BBI生命科學生物公司；FITC標記的抗RABV N蛋白的單克隆抗體由中國農業科學院特產研究所保存。

1.3 病毒培養 待VDS在T-75 cm2細胞培養瓶中長成單層細胞，接種CDV LN（10）1株1 mL（106.0TCID50/mL），并于37℃、5% CO2的培養箱中培養72 h，每日觀察細胞狀態，待細胞病變達到80%左右，反復凍融細胞3次后收取病毒液；將F81細胞均勻鋪于T-75 cm2細胞培養瓶中，同時接種CPV JL(18)1-Beagle株1 mL（106.0TCID50/mL），培養、收毒與檢驗病毒方法與增殖CDV的方法一致；待T-75 cm2細胞培養瓶BHK-21細胞長成單層細胞時，接種RABV弱毒HEP-Flury株1 mL（105.67TCID50/mL），并置于37℃、5% CO2培養箱中進行病毒擴增培養，96 h后通過反復凍融3次后收獲病毒液。

1.4 病毒含量測定與純凈性檢驗 將VDS細胞均勻鋪于96孔板中，待細胞長成單層時，將待測病毒液LN（10）1以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），并依次加入96孔板中，每個梯度4個重復孔，置于5% CO2培養箱內37℃培養4 d～5 d，逐日觀察細胞病變情況并記錄結果，按照Reed-Muench法計算病毒含量[22]。將F81細胞均勻鋪于96孔板中，同時將待測病毒液JL（18）1-Beagle以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），后續步驟與測LN（10）1方法一致。

將BHK-21細胞均勻鋪于96孔板中，待細胞長成單層時，將待測病毒液HEP-Flury以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），依次加入96孔板中，每個梯度4個重復孔，置于37℃、5% CO2溫箱中培養72 h后，PBS溫和洗滌2次，4%多聚甲醛4℃固定細胞30 min，棄液，干燥10 min，加入FITC標記的抗RABV N蛋白的單克隆抗體，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，加入適量的80%甘油，熒光顯微鏡下觀察結果[31]。

分別取收獲的3種病毒混合液，按《中華人民共和國獸藥典》（2015年版三部）（以下簡稱《中國獸藥典》）[32]進行無菌檢驗和支原體檢驗。

1.5 病毒滅活與疫苗制備 3種病毒分別應用PBS按CDV（106.0TCID50/mL）、CPV（106.0TCID50/mL）、RABV（105.67TCID50/mL）的比例進行病毒抗原液配制，按1∶2000比例加入β-丙內酯，徹底混勻后4℃滅活24 h后37℃水解1 h，即成滅活病毒液。取滅活CDV、CPV和RABV用DMEM培養基1∶5稀釋后分別接種VDS、F81和BHK-21細胞，細胞置37℃培養3 d后再傳1代，觀察3種細胞有無細胞病變，未見細胞病變即判定病毒滅活合格。

將MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)和Al(OH)33種佐劑分別與滅活病毒液（RABV∶CDV∶CPV=1∶1∶1）按1∶4比例混合均勻，制備成三聯滅活疫苗，保存于4℃備用。

選取CDV、CPV和RABV抗原和抗體均為陰性的健康6周齡比格犬15只，每只皮下注射疫苗3 mL，連續觀察至第14 d，每天記錄是否出現局部或全身不良反應（表1）。

表1 比格犬疫苗接種分組及相關信息Table 1 Vaccination group and related information of Beagles

1.6 比格犬免疫試驗 選取RABV、CDV、CPV抗原和抗體均為陰性的6周齡比格犬30只，連續免疫制備的三聯疫苗3次，每次每只接種1 mL，每次間隔4周，并在每次免疫前和最后一次免疫后4周采集比格犬后肢靜脈血液于促凝管中，分離血清于-20℃備用（表2）。

表2 比格犬免疫分組信息Table 2 Immunized group of Beagles

1.7 病毒抗體效價測定 三聯滅活疫苗免疫比格犬后，血清中和法測定CDV中和抗體效價，血凝抑制試驗測定CPV抗體水平變化，ELISA試劑盒測定RABV抗體水平。

1.7.1 血清中和試驗 將分離后的血清用DMEM兩倍倍比稀釋10個梯度，56℃滅活30 min，濾過除菌后置-20℃保存備用。將CDV SD(14)7株病毒液用無血清的DMEM培養基稀釋成100 TCID50每100 μL。分別取病毒液和待檢血清各100 μL，37℃孵育1 h。將上述液體加入已長成單層VDS細胞的96孔板內，每個稀釋度4個重復孔，置于5% CO2培養箱內37℃培養4～5 d，并逐日觀察記錄結果，同時設置正常細胞對照組，采用Reed-Muench法計算結果[33-34]。

1.7.2 血凝抑制試驗 取25 μL待檢血清，加入血凝板第1孔，以2倍倍比依次稀釋至第10孔，每孔加入25 μL病毒抗原，于微型振蕩器上振蕩約1 min，將第11孔設置為病毒對照，第12孔設置為紅細胞對照，37℃靜置30 min；每孔加入1%的新鮮豬紅細胞25 μL，震蕩混勻，4℃靜置2 h后觀察結果。以能夠100%抑制紅細胞凝集的最高血清稀釋度為該血清的滴度，即血清血凝抑制效價[27,35]。

1.7.3 ELISA檢測抗RABV抗體 按照RABV抗體ELISA試劑盒說明書的操作方法檢測抗RABV抗體水平。

1.8 比格犬攻毒 在免疫接種3個月后，MONTANIDE GEL 02、ADJ-801（W）和Al（OH）3三組比格犬分別應用CDV強毒SD（14）7株和CPV強毒JL（18）1-Beagle株攻毒，其中SD（14）7采用肌肉聯合鼻內接種方式進行攻毒，每只1 mL，含100個半數致死量（LD50）；JL（18）1-Beagle采用口服方式攻毒，每只1 mL，含100個LD50（表3），每天觀察比格犬食欲、精神狀態等臨床指標。

表4 病毒含量與質量檢驗結果Table 4 Virus loads and quality test

2 結果

2.1 病毒含量測定結果 CDV、CPV和RABV三種病毒含量均超過105.67TCID50/mL，符合制備三聯滅活疫苗的毒種標準。對無菌、支原體檢測結果為陰性，均符合《中國獸藥典》（2015年版）規定[32]。

2.2 三聯滅活疫苗安全性檢驗結果 疫苗對比格犬進行3倍免疫劑量進行安全性檢驗，動物接種疫苗14 d內體溫、食欲和精神狀態均無異常，表明3批不同佐劑的三聯疫苗對比格犬具有較好的安全性（表5）。

表5 三聯疫苗滅活與安全性檢驗Table 5 Safety test of triple vaccine

2.3 三聯滅活疫苗免疫比格犬后抗體效價 比格犬在連續3次免疫期間，血清CDV中和抗體水平持續升高。ADJ-801（W）組，二免和三免后CDV平均抗體效價分別為1∶8.6和1∶50，三免后CDV抗體水平極顯著高于二免；而三免后MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組CDV平均抗體效價分別為1∶10.6和1∶6，極顯著低于三免后的ADJ-801（W）組。MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組在3次免疫期間，CDV抗體水平升高但差異不顯著（圖1A）。比格犬3次免疫期間，CPV血凝抑制抗體效價在一免后即開始上升，三免后ADJ-801（W）組CPV平均抗體效價可達1∶1024（圖1B）。隨著免疫次數增加，RABV抗體水平不斷升高，第二次免疫后，三組抗體水平均有所升高，MONTANID E GEL 02和ADJ-801（W）組RABV平均抗體效價分別為4.60 EU/mL、6.09 EU/mL，顯著高于首免；第三次免疫后，MONTANIDE GEL 02和ADJ-801（W）組RABV平均抗體效價分別為6.9 EU/mL和7.4 EU/mL（圖1C）。

圖1 免疫后比格犬血清抗體的測定Fig.1 Determination of serum antibodies in beagle dogs after immunization

2.4 比格犬攻毒后保護情況 免疫動物攻毒實驗結果表明，三聯滅活疫苗MONTANIDE GEL 02組對CDV和CPV的攻毒保護率均為60%；三聯滅活疫苗ADJ-801(W)組比格犬對CDV和CPV的攻毒保護率均為100%，存活比格犬健康狀態良好，無臨床癥狀出現；Al(OH)3組比格犬在連續3次免疫3個月后攻毒，攻毒犬均出現精神沉郁、食欲不振甚至廢絕癥狀，其中CDV攻毒組出現眼鼻分泌物增多等犬瘟熱癥狀；CPV攻毒組出現腹瀉等細小病毒病癥狀，最終100%死亡，結果見表6。

表6 疫苗免疫比格犬攻毒CDV和CPV后存活率Table 6 The protective rate of beagles after challenge with CDV and CPV

3 討論

目前，MONTANIDE GEL 02、ADJ-801（W）和Al(OH)3為用于動物疫苗制備的三種商品化水溶性佐劑[34]，本研究將經β-丙內酯滅活后的RABV、CDV和CPV分別與上述三種佐劑按一定比例混合，聯合免疫比格犬后進行疫苗免疫效果評價。因比格犬的成本比較高，本研究受限于實驗動物數量，選擇免疫評價中重要的指標進行評價，即重點比較了三種佐劑的效果，因此只設置了免疫（抗原分別與三種不同的佐劑搭配）組和未免疫（既不含有抗原也不含佐劑）組。疫苗連續三次免疫比格犬后，ADJ-801（W）組CDV中和抗體水平顯著高于MONTANIDE GEL02和Al(OH)3組。CPV血凝抑制抗體效價在第三次免疫后達到最高值，ADJ-801（W）組在第三次免疫后，CPV抗體平均效價可達1∶1024，據秦海斌等報道，當CPV血凝抑制抗體效價低于1∶80時，幼犬有感染CPV的風險，抗體高于1∶160時犬有可能出現隱性帶毒而不表現明顯臨床癥狀，當效價高于1∶640時能夠達到完全保護[36]。在疫苗第三次免疫后，ADJ-801(W)、MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組RABV抗體效價平均值分別為7.4 EU/mL、6.9 EU/mL及4.0 EU/mL，均顯著高于世界動物衛生組織（OIE）制定的標準，即被檢動物血清抗體大于0.6 EU/mL，則判定為具有保護水平[37]。綜上所述，ADJ-801(W)佐劑疫苗的免疫效果最佳。

為了評價研制的滅活三聯滅活疫苗能否對犬提供免疫攻毒保護，本研究在三次免疫比格犬3個月后對比格犬接種CDV強毒SD（14）7株和CPV強毒JL(18)1-Beagle株。從結果可以看出，MONTANIDE GEL 02組和Al(OH)3組三聯滅活疫苗對比格犬均起不到較好的免疫保護作用；而ADJ-801（W）組免疫犬獲得很好的保護?？袢《拘柙谏锇踩墝嶒炇也僮?，因此受實驗條件影響，本次沒有進行比格犬RABV攻毒試驗。薛素強等[37]研究發現狂犬滅活疫苗（dG株）在免疫家犬后12個月抗體效價達3.55 EU/mL，抗體陽轉率為80.0%，明顯高于OIE要求標準；李婷婷等[38]使用狂犬滅活疫苗（r3G株）免疫比格犬，測定3批疫苗的效價，結果顯示效價分別為5.06、5.38和5.30 EU/mL，均符合疫苗質量標準的要求且批次之間的穩定性較強。本研究三聯滅活疫苗在第一次免疫比格犬體后，RABV抗體含量已達到保護水平。在三次免疫比格犬后，三組組RABV抗體效價平均值分別為6.9、7.4及4.0 EU/mL，明顯高于OIE標準。說明本研究制備的三聯滅活疫苗免疫比格犬可提供較強的RABV免疫保護作用。

顏淑芹等[39]通過研究不同濃度氫氧化鋁對人用狂犬病純化疫苗效力的影響，發現氫氧化鋁免疫增強作用與很多因素有關，佐劑本身可刺激吞噬細胞活性，但過多的鋁佐劑反而會抑制抗原的釋放且對吞噬細胞有細胞毒的副作用也會降低免疫力。本研究Al(OH)3佐劑滅活三聯滅活疫苗免疫效果不佳，可能是在制備三聯滅活疫苗時Al(OH)3的添加量過高或過低，也有可能是溫度等因素對Al(OH)3佐劑性狀的影響[34]。有研究報道稱Al(OH)3不能有效誘導細胞免疫應答[40-41]，并且本研究僅測定了CPV血凝抑制抗體而不是中和抗體，而血凝抑制抗體水平不能完全反映血清對病毒的中和能力。因此，三次免疫后Al(OH)3組雖然產生了較高水平的血凝抑制抗體但也沒能阻止細小病毒對犬的致死性感染。同時，本研究攻毒時間是最后一次免疫后的3個月，抗體檢測時間為最后一次免疫后4周，時間間隔2個月，攻毒后Al(OH)3組比格犬100%死亡的原因亦可能是Al(OH)3組動物抗體水平下降過快所致。近幾年來，犬細小病毒疫苗免疫后仍然有CPV發病的報道，亦可能是由于上述原因引起[42-44]。

本研究ADJ-801（W）佐劑免疫比格犬后較其他兩種佐劑提高了CDV、CPV和RABV抗體水平，比格犬在CDV和CPV攻毒后獲得較好的免疫保護。ADJ-801（W）的主要成分包括卡波姆（Carbomer）增稠劑和CPC，CPC（因生產企業保密要求，暫未獲得其主要成分）是佐劑的主要功能成分。在對成品疫苗進行安全檢驗與后期三次連續免疫比格犬期間，并未發現比格犬有任何不良臨床反應。因此，ADJ-801（W）是一款良好的疫苗免疫佐劑，安全性高，為研制犬三聯滅活疫苗以及預防和控制狂犬病、犬瘟熱及犬細小病毒病的流行提供幫助。滅活疫苗具有研制工藝簡單、安全性高等優點，并可與其他滅活病毒聯合免疫動物，通過減少接種針次，避免對動物造成應激反應。未來在研制三聯滅活疫苗時，建議重點關注如何提高免疫效力和降低免疫接種次數，達到在較少免疫次數下，免疫動物能得到較好的免疫保護。