泡球蚴肝門靜脈注射感染小鼠方法的建立

郭寶平，田夢瀟，吳川川，張 耀，武 娟，李 軍，郭 剛，齊文靜，任 遠，張文寶

（1.新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830011；3.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；4.新疆醫科大學 省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊 830011）

泡球蚴?。╝lveolar echinococcosis,AE）是由多房棘球絳蟲（Echinococcusmultilocularis）的幼蟲-泡球蚴感染引起的致死性寄生蟲病[1]，在肝實質內呈彌漫性浸潤生長。AE是寄生于人體的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，主要分布在北半球[2-3]。實驗室前期發現，AE病人病灶中持久的的炎癥反應導致肝壞死，壞死病灶直徑可達15～20 cm，出現明顯“包囊”的形狀，病灶可以使肝臟完全喪失功能，是病人死亡的主要原因[4]。

目前，泡球蚴的動物感染模型，主要是通過腹腔接種實驗動物建立的，然而該方法不僅感染率低、死亡率較高，而且原頭蚴（Protoscoleces,PSCs）及生發層細胞大部分附著在腹腔生長發育，肝臟僅感染少部分注射的PSCs及生發層細胞[5-6]，不能準確計算PSCs的感染量，更不能很好地反映肝臟原發病灶的生長發育情況，以及感染泡球蚴后肝臟的免疫機制，僅能用于傳代保種[7-9]。本實驗采用肝門靜脈注射方式建立了穩定的動物感染模型，采用這種方法不僅能準確定量注射的PSCs數量，并且術后實驗鼠成活率較高。

1 材料和方法

1.1 倫理審查 本研究獲得了新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物使用與管理委員會的批準（批準號為：IACUC-20180329-16），所有的實驗及樣本取材過程均符合新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會要求，并且所有實驗均嚴格遵循動物實驗的相關倫理學標準。

1.2 材料 C57實驗小鼠購自中國維通利華公司；PBS購自美國Thermo Fisher公司；多聚甲醛購自中國Biosharp公司；二甲苯和無水乙醇購自中國福晨化學試劑有限公司；鹽酸乙醇，實驗室自配，99 mL無水乙醇中加入1 mL濃鹽酸，密封備用；石蠟購自德國Leica 公司；中性樹膠購自中國上海標本模型廠；伊紅和蘇木素購自中國中衫金橋公司；Masson染色試劑盒購自中國福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 PSCs的分離及活性檢測 取經腹腔感染泡球蚴的昆明（Kunming,KM）小鼠，頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇中，進行體表滅菌3 min。用滅菌的剪刀打開腹腔，再用剪刀和鑷子將腹腔的泡球蚴組織取出，置于無菌平皿中，用生理鹽水沖洗2～3次。用剪刀將泡球蚴組織剪碎，置于平皿內，取一部分組織放入研缽中，用杵搗碎，研磨，加入5 mL生理鹽水，先用單層紗布過濾至50 mL離心管中，自然沉淀5 min，去掉上清液，沉淀用70目的尼龍網過濾至50 mL離心管中，再自然沉淀。將沉淀置于培養皿中，不斷用巴氏管吹打攪拌液體周圍，使培養皿中的混合物形成湍流，最后分成三層，內層為包囊及宿主臟器碎片，中間層為淡黃色的PSCs，外層為鈣質。用巴氏管將中間層的PSCs吸到另一個培養皿中。重復吹打分離3次以上。將收集的PSCs合并，加入終濃度為1%的胃蛋白酶（pH2.0）中，37℃消化15～30 min，每5 min觀察一次，當發現無雜質或非常少時即可停止消化（圖1）。消化結束后用生理鹽水再洗3～5遍，以去除角質層碎片和未成熟或活力不好的PSCs[10]。取一定量消化后的PSCs于1.5 mL EP管中，以0.1%的亞甲基藍染色1 min后棄去染液，用PBS洗1～2遍，棄去上清液。將沉淀置于載波片上，在顯微鏡下觀察PSCs的活性、形態、數量并計算活力[6]。

圖1 胃蛋白酶消化前后的PSCsFig.1 PSCs before and after pepsin digestion

1.4 PSCs經肝門靜脈注射感染小鼠方法 根據感染小鼠模型的時間效應和致病力的大小，設3個時期，分別為1個月（M）、3個月和6個月，同時設對照組（CON組）。將實驗小鼠開腹后，經肝門靜脈注射2000個PSCs，CON組注射200～300 μL生理鹽水。具體操作如下：小鼠在手術前12 h禁止給食，麻醉前1 h禁止給水。實驗鼠稱重，并用推子剃掉腹部被毛，防止術后感染。用10%水合氯醛麻醉劑（原濃度：0.1 g/mL）對小鼠進行腹腔注射麻醉，將等體積的10%水合氯醛與0.9%生理鹽水混勻后，每只實驗小鼠按6 μL/g體重進行注射[11]。大約20 min后，當小鼠不能自由翻身并處于昏迷狀態時將小鼠固定于解剖臺上，碘伏消毒腹部。沿小鼠腹部正中剪開皮膚，用手術剪小心剪開真皮層，創口約為2～3 cm。將小鼠腸、胃等暴露出來，在近肝端可見顏色較深且粗的靜脈血管（圖2），即為肝門靜脈，稍提肝門靜脈前端的脂肪組織，使用24 G的頭皮針穿刺，透過靜脈管壁可看到針頭。按照2000/100 μL PSCs的濃度，混勻后注射100 μL的懸浮混合物后，再注射總體積100～200 μL鹽水以沖洗頭皮針內殘留的PSCs，使PSCs混合物總體積達到200～300 μL。注射完成后迅速拔出針頭，用半干的棉簽壓迫止血1～2 min，將小鼠所有器官回歸原位。由于手術過程中，小鼠腹腔會少量失水，因此縫合前需要給小鼠腹腔注射少量生理鹽水。用可吸收縫合線縫合創口處，4～5針即可，用碘伏消毒縫合處，將小鼠放回籠內，置于23℃的加熱臺上或電熱毯上，上下各墊一層紗布以保持體溫，并注意監測小鼠體溫，籠中保持干燥，無積水或粉塵，防止小鼠誤吸窒息。悉心飼養，每日觀察記錄。

圖2 小鼠肝門靜脈注射感染方法示意圖Fig.2 Sketch map of PSCs infection by hepatic portal vein injection

1.5 肝臟組織標本包埋和切片觀察 于感染后不同時間處死并剖檢實驗鼠，觀察并記錄肝臟表面病灶，再將肝臟組織固定、包埋、切片、展片、烤片和HE染色等步驟[6]。將切片置于100倍顯微鏡下，觀察肝臟組織病理變化，隨機選擇5個無重復的視野，觀察并記錄每個視野的病理變化及PSCs的數量。

1.6 肝臟組織標本Masson染色觀察 根據Masson試劑盒操作手冊，將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脫蠟10 min；再將切片依次放入100%、95%、85%、70%乙醇中，每次5 s，用蒸餾水沖洗殘余的乙醇，用濾紙吸干多余的水分，再用干凈的吸水紙小心擦去組織邊緣多余水分，切記不可使組織表面干燥；滴加1滴染色液（試劑A），染色5 min，用蒸餾水沖洗殘余的染液；滴加1滴磷鉬酸（試劑C），染色5 min，甩干；滴加1滴苯胺藍（試劑D），染色5 min，用蒸餾水沖洗殘余的染液；滴加1滴分化液（試劑B），分化30～60 s（2次）；以二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明約5 s，再用中性樹膠封片并加蓋玻片；在顯微鏡下觀察肝臟組織纖維化染色結果，100倍視野下，隨機選擇5個無重復的視野，利用Olympus光學顯微鏡的cellSens掃描軟件分析染色結果，計算每張切片陽性染色面積占總視野面積的比值[12]。

1.7 統計分析 用Graphpad Prism 7.0軟件進行作圖及統計分析，所有的計量資料均以mean±SEM表示，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗方法。

2 結果

2.1 實驗鼠術后成活率 肝門靜脈感染小鼠后，小鼠手術存活率達到85.00%（34/40），能夠保證后續實驗的順利進行。

2.2 病灶特點 小鼠感染后1個月，可以看到感染組實驗鼠肝臟表面均存在不透明黃灰色點狀病灶，整個肝臟充滿了不透明黃灰色點狀病灶，猶如“滿天星”，直徑約1 mm；感染后3個月，肝臟表面可見少量明顯的、直徑5 mm×5 mm大小的續絳期小泡[13]，而對照組實驗小鼠肝臟無任何明顯病灶（圖3a，3b）。

圖3 小鼠感染PSCs后肝臟病變Fig.3 Liver lesions in different groups of mice infected with PSCs

2.3 成“泡”率 小鼠感染后6個月，感染組肝臟小“泡”比較明顯，成“泡”率達到了50.00%，對照組則無明顯變化（表1）。

表1 肝門靜脈注射感染實驗鼠包囊數及感染率Table 1 The cyst number and infection rate of mice infected by hepatic portal vein injection

2.4 實驗鼠肝臟病變 PSCs感染小鼠后不同時間，肝臟病理表型和病變程度在一定差異，結果如圖4A所示。感染后1個月，僅發生纖維化反應，感染的肝臟局部壞死，肝小葉結構紊亂，匯管區有炎性細胞浸潤，感染的肝臟未見成“泡”反應，僅可見少量點狀炎性灶。感染后3個月，有纖維化反應伴有炎性細胞浸潤，周圍有大量的炎性細胞浸潤；肝臟急性炎癥反應增強，肝細胞腫大，匯管區有大量的炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞。感染后6個月，成“泡”感染的肝臟病灶繼續向外侵襲性生長，可見病灶部位有明顯的生發層結構，周圍炎性細胞浸潤進一步加重，纖維組織大量增生，并出現膽管增生，可見多個空泡狀結構，呈多蜂窩狀空腔，病灶內形成大量生發層，周圍存在大量的慢性炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、單核細胞和粒細胞等為主；同時大量的小肉芽腫結節環繞，形成類似腫瘤樣結節，并伴隨大量的纖維化組織增生；在肝臟匯管區周圍產生大量的纖維化反應，病灶呈現彌漫性纖維增生、大量的肝細胞被纖維組織包圍纏繞，并且在炎性帶周圍有大量的肝細胞部分發生壞死。

圖4 小鼠感染PSCs后肝臟病理變化（A）及病灶數差異（B）Fig.4 The changes of liver histology (A) and the number of lesions (B) in different groups of mice infected with PSCs

HE染色發現，PSCs感染小鼠后不同時期，肝臟病灶數量存在差異（圖4B），其中6個月時候病灶數最多，1個月時病灶數最少。3個月時病灶數居中。不同時期病灶數的多少依次為6個月（32.75±7.98）＞3個月（20.86±6.10）＞1個月（13.25±1.83）＞CON（0.75±0.88）。統計分析表明，6個月組與3個月組病灶數量差異顯著（P＜0.05），與3個月及CON組差異顯著（P＜0.05，P＜0.001）；3個月組與1個月組差異極顯著（P＜0.001），與CON組差異極顯著（P＜0.001）；1個月組與CON組差異極顯著（P＜0.001）。

2.5 實驗小鼠肝纖維Ⅲ型膠原酶（Collagen type ⅢalphaⅠ,COL3A1）的變化 使用Masson染色試劑盒對不同時期感染泡球蚴小鼠肝臟纖維化程度進行染色。結果發現，在1個月時感染的肝臟病灶存在少量的膠原纖維沉積，肝臟病灶周圍炎性帶也出現一定的纖維化發生；3個月時與6個月時感染的肝臟病灶附近有大量膠原沉積，一部分纖維組織延伸至小葉間，呈同心圓狀排布，可見明顯的纖維化病灶，主要以膠原沉積為主（圖5A）。利用cellSens軟件掃描分析顯示，其中6個月時纖維化最嚴重，1個月時纖維化較輕，3個月時病灶數居中。不同時期病灶數的多少依次為6個月（28.04±15.48）＞3個月（22.88±5.17）＞1個月（8.58±3.89）＞CON（0.65±0.18）。統計分析表明，6個月時與3個月時差異極顯著（P＜0.001），與3個月時及CON組均差異極顯著（P＜0.001）；3個月時與1個月時及CON組均差異極顯著（P＜0.001）；1個月時與CON組差異亦極顯著（P＜0.001）（圖5B）。

圖5 不同組小鼠感染PSCs后肝臟纖維化程度（A）及病灶數差異（B）Fig.5 The changes of liver fibrosis (A) and the number of lesions (B) in different groups of mice infected with PSCs

3 討論

目前已經報道的泡球蚴感染方法包括開腹直視肝臟穿刺法、腹腔皮下接種法、肝門靜脈接種法、口服蟲卵感染法及腹腔注射感染法等[14-15]，除口服蟲卵感染法外，其余均為繼發感染模型，存在感染率低，死亡率較高，不能準確定量PSCs等缺點，并且這些方法不能用作動物模型來研究PSCs感染后肝臟的病理變化，更不能評價不同時間段PSCs致病差異的研究。雖然口服蟲卵感染能模擬自然感染，且感染率較高，但是這種方法受蟲卵、實驗室條件及安全等因素的限制，不適合在實驗室推廣使用。先前已有肝門靜脈實驗[11,13]，但是由于對分離的PSCs未做消化處理，注射的PSCs混有宿主和包囊組織碎片及大量活性不高的PSCs，造成宿主非特異性免疫反應，所以需用胃蛋白酶消化，去掉組織碎片及活性不高的PSCs[6]。本研究使用肝門靜脈注射方式感染小鼠，成功建立了泡球蚴小鼠感染模型，該模型能較好地模擬原發感染和肝臟病理變化，可作為泡球蚴感染宿主免疫應答機制差異的研究，為包蟲病在中間宿主肝臟免疫研究提供了一個非常穩定的動物模型。

本研究術后成活率較高，達到85.00%，成活率能保證后續是研究的開展，造成死亡的原因主要是術后出血，主要是門靜脈穿刺后按壓時間不夠及縫合時造成穿刺部位再次出血造成死亡。另外，腸漏是造成死亡的一個重要原因，由于縫合線打結不緊以及兩針之間距離較大，術后腸漏導致死亡。與腹腔注射相比，腹腔注射后，包囊在腹腔生長較快，感染3個月開始出現死亡，半年后已有20%以上的死亡率，加之腹腔為繼發感染，所以無論從成活率以及感染方式上，肝門靜脈感染非常適用于小鼠感染模型的建立。

實驗鼠感染PSCs肝臟后，許多非常小的病灶聚集在一起，并向肝組織周圍膨脹浸潤，引起肝臟局部組織病變，例如肝纖維化、增生、變性、萎縮、壞死等[16-18]。在感染后的發展過程中，主要的病理變化是病灶周圍纖維化及大量的炎癥細胞聚集。在肝纖維化的形成過程中，當有炎癥或者感染時，肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSK）會被激活，最終分化為肌成纖維細胞，該細胞可分泌大量細胞外基質成分（extracellular matrix,ECM），包括COL3A1蛋白，同時使膠原酶的活性降低，造成細胞ECM的產生和降解不平衡，進而造成肝纖維化，COL3A1蛋白高表達，因此，COL3A1蛋白可以作為肝纖維化的標志物[18]。本實驗選用COL3A1作為小鼠感染PSCs后肝臟病理變化的檢測指標，結果表明：小鼠感染PSCs后，COL3A1表達量出現了不同程度的變化，并且變化的趨勢一致，6個月時組肝臟病灶周圍表達量最高，1個月時組表達量最低，與對照組相比，均出現顯著性差異（P＜0.05）。

小鼠感染PSCs后，會形成典型的肝臟病理變化，包括肉芽腫的形成及肝纖維化[13]，在早期炎癥的發生和發展中使感染的組織附近形成囊泡。在肉芽腫周圍，膠原蛋白定位于肉芽腫周圍并大量表達。在PSCs感染后，一般分為3種較為明顯的反應：僅存在纖維化反應，伴有炎性細胞浸潤及病灶肉芽腫伴纖維化[19-20]。與之前的研究相似[6,13]，本研究發現大量的膠原蛋白在蟲體病灶周圍表達，并伴有纖維化和炎性細胞浸潤，尤其是6個月時，有4只實驗小鼠肝臟成“泡”樣感染，成“泡”數量及成“泡”率高于其他實驗組，在成“泡”的同時，病灶周圍產生大量的肌動蛋白A（Actin alpha，smooth muscle aorta,α-SMA）及數量不等的病灶數。肉芽腫周圍形成的膠原沉淀會影響的門靜脈血液流動，從而誘發門靜脈高壓[21-22]。肉芽腫的形成是把“雙刃劍”，一方面肉芽腫破壞、隔離PSCs的感染，另一方面使宿主肝臟組織受到破壞，導致大量的肝纖維化出現，并且在肝表面形成大量的病灶[23]。在感染進程中，肉芽腫變大的同時，炎癥的數量細胞也在增加，并且大量的纖維細胞出現在病變的邊緣，膠原纖維變得更長、更厚，尤其在成“泡”感染后，感染的組織周圍尤為明顯，肉芽腫在后期也比較多，在感染比較嚴重時，纖維化反應伴有大量的炎性細胞浸潤；肝臟急性炎癥反應增強，并且肝臟細胞腫大，匯管區有明顯的炎性細胞浸潤，包括Mφ、淋巴細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞[24-25]。膠原蛋白在病灶區包圍并浸潤到卵肉芽腫中，聚集在纖維化附近區域，并延伸到纖維間隔[25]。

綜上所述，本研究從實驗動物、注射方式，PSCs感染量、PSCs處理方式以及麻藥劑量等相關因素探索了肝門靜脈接種方法，成功建立了穩定的C57小鼠感染模型，為今后包蟲病免疫學、分子生物學、藥物篩選等后續研究的開展提供了基礎。