鵝星狀病毒Ⅰ型熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

謝 軍，張 碩，王安平，吳 植，吳 雙，朱善元

（江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室 江蘇現代畜牧與新獸藥工程技術中心，泰州 225300）

近年來，我國華北、華中、華南等多地區鵝廠暴發了一種以關節型和內臟型尿酸鹽沉積為主要特征的致死性傳染病因尿酸鹽沉積現象，民間將其稱為痛風病[1-2]。該病主要侵害5～20日齡的雛鵝，死亡率可高達50%，對我國養殖業經濟發展造成了嚴重的威脅[3]。造成鵝痛風的原因有很多，飼料蛋白水平不均衡，飼養環境不佳、腸道菌群失衡或星狀病毒感染等多種原因均可出現雛鵝痛風現象[4-5]。但是在一些飼喂合理、環境溫暖、干燥、保溫性能好，空氣流通通暢，養殖密度合適的鵝廠依然會出現痛風現象，因此懷疑此種痛風是由一種病原感染引起的[6-7]。

鵝痛風給鵝養殖業帶來了巨大的經濟損失。2017年，刁有祥教授[7]首次揭示了引起鵝痛風的病原體為鵝星狀病毒（Goose Astrovirus,GAstV）。GAstV屬于無囊膜的正鏈單股RNA病毒，基因組全長為6.9～7.9 kb[8-9]。在電子顯微鏡下可以觀察到鵝星狀病毒表面有5～6個突起，結構呈星形，故稱之為星狀病毒。目前，GAstV全基因組序列分析表明，GAstV具有兩種不同的基因型，即GAstV-1和GAstV-2。GAstV-2已從鵝痛風組織中被成功分離出來，而雛鵝回歸實驗亦證明其能引起鵝痛風[10]。

2016年，我國大部分商品鵝群中暴發了以內臟和關節尿酸鹽沉積為主要特征的致死性傳染病，姜曉寧等[11-12]研究發現，鵝痛風的病原為GAstVs[11-12]。2017年，首次報道第一株GAstV FLX全基因組序，基因組全長7299 nt[6,13]。之后另有幾株GAstVs相繼被測序或分離，如HN1G[12]、SDPY[11]、CXZ/18[14]、SD01[11]、GD[15]。然而，基因組同源性分析顯示，后續測序的GAstVs毒株與FLX株同源性均不到60%，遺傳進化分析也表明這些毒株遺傳進化關系與FLX株相距較遠，說明我國鵝群中存在不同基因型GAstV，李盈等[16]建議將FLX類毒株命名為1型鵝星狀病毒（GAstV-1），SD01類毒株命名為2型鵝星狀病毒（GAstV-2），又被稱為新型鵝星狀病毒。

迄今為止尚無疫苗可以有效治療鵝痛風病。部分養殖場嘗試采用自免血清進行病鵝緊急治療，然而效果也不理想。從當前情況可知，針對鵝痛風病，養殖商品鵝過程中除了通過疫苗、抗體加強進行免疫保護外，更需要通過建立一種快速、靈敏、有效的鵝星狀病毒檢測方法，以在鵝痛風病早期進行疫病的預防性檢測和臨床監測。王安平等[6]將宏基因組學應用于鵝痛風病的診斷中，但該方法成本較高、操作步驟復雜等原因不適用于規?；瘷z測[6]。李陽等[17-18]發現，可利用RT-PCR/一步法RT-PCR進行鵝痛風病病原檢測，然而RT-PCR檢測方法靈敏度低，無法對檢測樣品進行定量分析。熒光定量PCR技術因其靈敏度高、耗時短、操作簡便，同時彌補了常規PCR技術無法定量分析的缺點，現被廣泛使用于臨床樣品的檢測[19-20]。

為此，本研究使用MegAlign軟件比對TZ03（GenBank登錄號：MW353015）和NCBI下載序列，選取GAstV-1 ORF1b高度保守區內RdRp基因序列設計了一對特異性引物和探針。通過構建重組質粒pET30a-ORF1b，建立了用于檢測GAstV-1的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，以期促進鵝星狀病毒病的臨床快速診斷，進一步推動星狀病毒的感染防制工作。

1 材料與方法

1.1 病毒及其他病原菌 鵝Ⅰ型星狀病毒TZ03毒株為江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室于2019年從江蘇地區鵝場呈現出明顯痛風癥狀的病鵝肝臟、脾臟、腎臟等組織分離獲得，暫命名為GAstV/CHN/TZ03/2019；新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）La Sota 疫苗株由揚州大學劉秀梵院士惠贈，鵝細小病毒（Goose parvovirus,GPV）SYG41-50疫苗株和番鴨細小病毒（Muscovy duck parvovlrus,MDPV）P1 疫苗株分別購自揚州威克生物工程有限公司和青島易邦生物工程有限公司，鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）（Duck/JiangSu/24/2018）和禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）H9N2亞型（Duck/XuZhou/515/2018）由中國農業科學院上海獸醫研究所丁鏟研究員惠贈；鵝圓環病毒（Goose circovirus,GoCV）（Goose/Jiangsu/02/2019）、鵝源大腸桿菌APECYE2-1-1（Goose/Taizhou/2019）、鴨疫里默氏桿菌（Duck/Jiangsu/08/2019）等由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室自行分離、保存。

1.2 試劑與儀器 Magbead Viral DNA/RNA Kit磁珠核酸提取試劑盒購自江蘇康為世紀（中國）有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒均購自康寧生命科學（吳江）有限公司；PremixTaqDNA預混酶、Prime Script RT Master Mix反轉錄試劑盒和無菌超純水購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）購自天根生化科技（北京）有限公司；QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀器購自美國應用生物系統公司（Applied Biosystems）；Qubit 4.0核酸定量儀熒光、Thermo Scientific KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統計購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設計與合成 于GenBank數據庫中下載Goose astrovirus基因序列，使用MegAlign軟件比對序列后，選取GAstV-1 ORF1b高度保守區內RdRp基因（GenBank登錄號：MW353015），使用Applied Biosystems Q3熒光定量儀配套軟件Primer Express Software Version 3.0設計引物和探針，以及用作質粒標準品構建的一對引物（表1）。引物和探針均由英濰捷基（上海）有限公司合成。

表1 qPCR引物及探針序列Table 1 Primers and probes designed for qPCR

1.4 標準品的構建 選取GAstV-TZ03 cDNA作為擴增模板，PCR擴增體系（50 μL）為：PremixTaq（TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye）25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃再延伸10 min；12℃保存。PCR產物經過凝膠電泳分離后，參照凝膠回收試劑盒說明書收集核酸，將其與克隆載體pET-30a連接，轉化后將PCR條帶大小正確的陽性克隆菌送至英濰捷基（上海）有限公司進行測序，測序結果與NCBI上已發布的序列進行比對，將正確重組質粒pET30a-ORF1b作為該檢測方法的標準品。使用Qubit 4.0核酸定量儀熒光計對重組質粒測定濃度。使用以下公式計算重組質粒的拷貝數：拷貝數＝（6.02×1023）×（質粒濃度×10-9）/（質粒長度×660）

1.5 核酸提取 取GAstV-1 (TZ03)、NDV (La Sota)、AIV-H9、DTMUV尿囊液，GoCV組織碾磨液，GPV、MDPV疫苗稀釋液，使用Thermo Scientific KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統進行核酸提取，提取的DNA置于-20℃低溫保存，因GAstV-1、NDV和AIV-H9病毒為RNA病毒，參照試劑盒對提取RNA進行反轉錄cDNA置于-20℃保存；細菌參照細菌DNA提取試劑盒，獲得的DNA置于-20℃保存。

1.6 熒光定量PCR方法的建立及優化 反應體系（20 μL）為：2× Premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，50× ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA/cDNA模板1 μL，上、下游引物和探針（10 μmol/L），其余ddH2O補足20 μL。使用方陣試驗，摸索退火溫度、引物和探針濃度等條件以篩選出最佳反應體系，即引物和探針終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol/L；退火/延伸溫度為57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃不斷優化以獲得更好的反應結果。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃退火10 s，退火/延伸40 s，擴增40個循環后收集熒光信號，用于結果的判定。

1.7 標準曲線的建立 取鵝星狀病毒重組質粒標準品，加入ddH2O進行10倍系列梯度稀釋，最終濃度為1×101～1×107copies/μL，按照“1.6”中反應體系和條件進行操作，繪制TaqMan qPCR方法的標準曲線。每個濃度梯度實驗設3個重復，并采用ddH2O作為陰性對照。

1.8 特異性實驗 為檢測qPCR實驗結果的特異性，使用病毒核酸提取試劑盒分別提取 MDRV、DTMUV、MDPV、AIV（H9N2）、GPV、DuCV病毒RNA，并將RNA反轉錄為 DNA；使用細菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌基因組DNA，以DNA為模板，驗證該方法的特異性。

1.9 敏感性實驗 按1×101～1×105copies/μL對重組質粒標準品進行倍比稀釋，以優化后反應體系和條件進行稀釋濃度的最低限度檢測，驗證該方法的靈敏性。使用RT-PCR進行靈敏度比對性檢測。

1.10 重復性試驗 為驗證qPCR實驗結果的可重復性，使用10倍梯度稀釋為104～106copies/μL的混合標準質粒來分析組內及組間變異。在相同的條件下在同一個96孔板上做3個重復，測定組內變異系數；分3個時間段就同一批樣品進行重復檢測，批次樣品單次檢測時設定3個重復組，進行組間變異系數測定。

1.11 臨床樣品的檢測 對依托江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室和江蘇現代農業（水禽）產業技術體系集成創新中心，經過NGS測序后的13份已知背景的田間臨床樣品進行驗證。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 以 GAstV-1(TZ03) cDNA為模板進行常規 PCR 擴增，獲得 GAstV-1 的ORF1b基因片段（1542 bp），片段大小與目的片段一致（圖1）。經膠回收、連接、轉化、陽性克隆菌擴增及質粒提取，陽性菌測序結果與預期一致，表明成功建立重組質粒標準品并命名為pET30a-ORF1b。

圖1 pET30a-ORF1b酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET30a-ORF1b by restriction enzymes digestion

2.2 TaqMan qPCR 標準曲線建立 將重組質粒梯度稀釋，制備成1×102～1×107copies/μL的重組質粒標準品。根據優化的反應體系和條件繪制qPCR的標準曲線。結果顯示，GAstV-1病毒可得到具有良好的相關系數及擴增效率的標準曲線，R2=0.998，E=99.6%（圖2）。

圖2 GAstv-1 qPCR 擴增曲線及標準曲線Fig.2 Amplification curve and standard curve of single qPCR for GAstv-1 E =99.6%,R2 =0.998 ,Slope = -3.394,Y-Inter = 39.812

2.3 TaqMan qPCR特異性試驗 以TZ03的cDNA作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照，對NDV、GPV、MDPV、DTMUV、AIV-H9、GoCV、鵝源大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌的DNA/cDNA 進行特異性檢測。結果顯示，除陽性對照組，其余6種病毒、2種細菌和陰性對照組均未檢測到熒光信號（圖3）。建立的qPCR方法在不同病原的檢測結果中具有良好的特異性。

圖3 GAstv-1 qPCR 特異性檢測Fig.3 Specific detection of single qPCR for GAstV-1

2.4 TaqMan qPCR靈敏度試驗 重組質粒標準品按1×101～1×105copies/μL進行倍比稀釋，并以上一步驟優化條件進行qPCR檢測。結果顯示：GAstV-1的qPCR的靈敏度約為10 copies/μL，陰性對照無擴增。而常規PCR靈敏度檢測結果：靈敏度近1000 copies/μL（圖4～5）。由此表明，GAstV-1病毒的qPCR檢測方法具有較高靈敏度，且較常規PCR高100倍左右。

圖4 GAstV-1 qPCR靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of single qPCR for GAstV-1

圖5 GAstV-1 PCR 靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity detection of single PCR for GAstV-1

2.5 TaqMan qPCR 重復性試驗 利用構建的熒光定量PCR法對不同批次不同濃度的重組質粒標準品進行檢測。結果顯示，GAstV-1 TZ03株組內變異系數為0.10%～0.34%，組間變異系數為0.28%～0.60%（表2）。

表2 qPCR法組內、組間重復性試驗結果Table 3 Results of repeatability test within and between single qPCR groups

2.6 臨床樣品檢測 依托江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室和江蘇現代農業（水禽）產業技術體系集成創新中心，提供13份已知背景的田間臨床樣品對建立的檢測方法進行驗證。利用構建的熒光定量PCR法檢測出13份田間臨床樣品的陽性，0份田間臨床樣品為陰性，與13份田間臨床樣品的已知背景情況相符。

3 討論

我國是水禽生產、消費大國，肉鵝出欄量常年穩定在5億羽以上、種鵝存欄量在2千萬羽以上，產值高達500億元以上。但自2016年以來，我國商品鵝飼養時發現鵝群中出現了以皮下、組織、關節等部位尿酸鹽堆積的臨床癥狀疾病，患病雛鵝死亡率高達50%，單日死亡率最高可達存欄量的15%，耐過鵝也會表現出生長遲緩，甚至還會繼發感染細菌疾病，嚴重威脅到我國肉鵝養殖業的經濟發展[21]。大量研究表明，雛鵝飼喂過程中補充過量的高蛋白、高鈣飼料，很容易導致尿酸產生過多或飲水不足、排泄障礙，引發大量尿酸鹽堆積，從而引起營養代謝性疾病[17]。同時有研究證明鵝星狀病毒是導致鵝痛風的主要原因之一[1,22]。研究發現，鵝痛風病主要是由1型和/或2型星狀病毒感染引起的，臨床癥狀和病理變化較相似，很難通過肉眼進行區分，給臨床檢疫帶來了困難[23-24]。

TaqMan qPCR方法和常規PCR法比較，前者靈敏更高、結果重復性更佳、特異性更強等，被廣泛用于臨床樣品的檢測和篩查。構建TaqMan qPCR檢測法的關鍵在于引物和探針的設計，良好的引物和探針是該法構建成功的重要保證。先在GenBank上下載獲得病毒目的基因全部序列，使用MegAlign軟件進行序列比對，篩選出ORF1b高度保守區內RdRp基因，使用Primer Express Software Version 3.0設計引物和探針。引物設計時選擇退火溫度為59℃～60℃，因探針退火溫度宜高于引物8℃～10℃，所以探針的退火溫度設定為68℃～70℃，以確保探針的優先結合。反應體系經引物、探針條件摸索，優化結果為：95℃預變性30 s；95℃退火10 s，退火/延伸40 s，擴增40個循環。試驗結果顯示建立的TaqMan qPCR方法具有良好的標準曲線，擴增效率（E）為92%～103%，R2在0.996以上，即表明鵝星狀病毒的目的基因得到良好的擴增；特異性檢測結果表明，通過檢測GAstV、NDV、DTMUV、AIV（H9N2）、GPV、GoCV、水禽大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌等病原菌，除鵝Ⅰ型星狀病毒外，其他水禽相關病毒、細菌均無擴增；通過不同時間段進行實驗，組內變異系數為1.02%～3.11%，組間變異系數為1.09%～3.67%，引物的重復性良好；通過實驗室保存的陽性臨床樣品進行檢測，檢測結果與NGS測序結果一致。

由此可見，本研究成功構建了靈敏度高、特異性強、重復性好的GAstV-1 TaqMan qPCR檢測方法。該方法的建立為水禽養殖提供了早期快速診斷技術，對水禽養殖業的健康發展具有重要意義。