新疆伊犁地區不同馬場馬腺疫病原菌的分離及鑒定

買占海，周 軻，沙婭·奴爾蘭，魏彥明，況 玲

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；3.伊犁州動物疾病預防與控制中心，伊寧 835800）

馬腺疫是由馬鏈球菌引起的急性傳染病，是造成全球馬業福利和經濟損失的主要原因，該疾病最早由Jordanus Ruffus報道的[1]，其發病特點為易造成0.5～2歲馬駒發病，出現發熱，流鼻涕和頭頸部淋巴結膿腫。在嚴重的情況下，下頜或咽下淋巴結的腫脹可能會壓迫呼吸道限制呼吸，其臨床特征賦予了該病稱“馬腺疫”一詞[2]，且康復后存在復發的可能性。目前，該病幾乎在全世界呈現蔓延趨勢[3]，直接影響馬的生長、發育及繁殖，甚至嚴重阻礙了馬產業的發展。

馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus.equisubsp.zooepidemicus,SEZ）和馬亞種（Streptococcusequi subsp.equi,SEE）的病原菌是馬屬動物臨床上分離率最高的兩種型，而SEE是由SEZ變異而來的，其分類上與SEZ非常相近[4-5]。目前發現SEE和SEZ在基因學上具有92% DNA同源性[6]。纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）是一種大分子糖蛋白，存在于脊椎動物細胞外基質和體液中，與機體內的纖粘蛋白相結合[7]。鏈球菌產生幾種附著在細菌細胞壁上的纖連蛋白結合蛋白，其fneB毒力基因被發現包含一個堿基缺失，這導致C端細胞壁錨定域的丟失，并產生分泌截短纖維連接蛋白結合蛋白FNE，增強了鏈球菌的入侵潛力。馬鏈球菌還具有許多在動物鏈球菌中沒有發現的噬菌體相關的細菌超抗原，這些超抗原被認為與MHC II類抗原和T細胞受體分子同時結合，刺激T細胞和免疫反應，隨后釋放IL1、IL2、TNF-β和IL6等促炎細胞因子導致炎癥的發生，患畜出現發熱、中性粒細胞增多和血漿纖維蛋白原增加[2]。fneB常作為菌體表面起黏附作用的毒力蛋白，現有研究表明，PCR技術可以檢測fneB基因[8]。但到目前為止，國內關于SEE的fneB基因分子方面的研究鮮有報道。本研究對新疆伊犁地區SEE與SEZ進行分離株的分離和鑒定，并通過對患病馬血常規指標的檢測和統計分析，以期為新疆地區馬鏈球菌疾病的科學防控、診斷提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 革蘭氏快速染色液、pMD-19T、感受態細胞DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O、DNA Marker購自TaKaRa公司；陽性SEE菌株N20和N25由新疆農業大學中獸醫實驗室保存菌株。

1.2 病料采集 新疆昭蘇縣某三個馬場疑似發生馬腺疫，采集臨床特征具有精神沉郁，高燒，頭頸部淋巴結腫大，食欲下降，大量流漿液性甚至黏液性鼻涕患病馬駒的鼻拭子。首先將2根醫用無菌棉簽用裝有2 mL高壓滅菌的PBS液浸濕，深入患病馬駒鼻腔內沾取鼻內分泌物，或者無菌采集破潰淋巴結膿汁，將采集好的鼻拭子樣品從手接觸部位折斷后放入1.5 mL含PBS液的無菌EP管內，并做好標記。三個馬場（A馬場、B馬場、C馬場）采集鼻拭子和血樣分別為14份（A1～A14）、10份（B1～B10）、14份（C1～C14），以及C馬場2份頜下淋巴結破潰的膿汁，共40份；除患病馬匹樣品外，另在三個馬場各采集5匹健康馬的血樣15份（D1-D15），健康馬血清樣品共53份。

1.3 細菌的分離與培養 分別吸取從臨床采集的40份疑似患馬腺疫的樣品各200 μL，加至10 mL含有5%胎牛血清的THB液體培養基中，37℃、180 rpm恒溫震蕩培養24 h，在無菌操作臺上吸取20 μL增菌液劃線接種于5%綿羊鮮血瓊脂培養基上，37℃恒溫培養24 h。觀察鮮血培養基上的菌落形態，用接種環挑出具有β溶血的單個菌落，在鮮血培養基上劃線進行細菌的純化，直至培養基上無雜菌。

1.4 形態學觀察及生化鑒定 挑取1株純化后穩定的β溶血單菌落，對其進行革蘭氏染色并觀察其形態特征；將PCR鑒定為陽性的菌株分別加至鏈球菌生化編碼鑒定管中，觀察各鑒定管的顏色變化，結合《鏈球菌生化編碼鑒定手冊（GYZ-12ST）》進行結果判定。

1.5 PCR擴增 根據NCBI收錄SEE的4047個全基因組中fneB的基因序列，應用DNAStar設計其引物[9]，SEE菌株的PCR擴增序列和反應運行體系見表1[10]。PCR反應體系（25 μL）：Taq聚合酶預混染料（2×TaqPCR Green Mix）12.5 μL，上、下游引物各1 μL；細菌DNA模板2 μL，ddH2O補至25 μL。反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性30 s，49℃復性30 s，72℃延伸 90 s，共35個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增結束后，取6 μL反應產物在1×TAE緩沖液中、120 V恒壓條件下電泳30 min，然后在EB染液中浸染15 min后，在凝膠成像系統上觀察結果。

表1 本研究所用引物[10]Table 1 Primers used in this study[10]

1.6fneB基因的測序鑒定 根據膠回收試劑盒的操作說明回收PCR產物。PCR膠回收產物5 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD19-T 1 μL、Control Insert 3 μL混勻后16℃過夜連接，將連接產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.7 血涂片檢查及血常規指標測定 采集疑似患病馬匹血液，立即制備血液涂片：取1滴鮮血至載玻片上，將其推成舌狀，在光鏡下清晰可見紅細胞不黏連，每匹馬涂3張進行備用。用EDTA抗凝采血管采集5 mL血液，輕輕搖勻，使抗凝劑與血液充分混合均勻，留作血細胞分析待用。

1.8 數據分析 用SPSS 26.0統計軟件對血常規數據進行獨立樣本檢驗分析，當P＜0.05時表示差異顯著，具有統計學意義。試驗結果以“平均值±標準誤差”表示。

2 結果與討論

馬腺疫是最常見的馬呼吸道疾病之一，病原菌為SEE，是一種革蘭氏陽性的β溶血細菌[11]。該病在世界各地馬屬動物身上均有暴發，嚴重影響馬匹健康和制約著馬產業的發展，給養殖戶及馬場等企業造成了巨大的經濟損失[12]。帶菌馬匹已被認定是維持病原體長期存在且容易造成感染的關鍵因素，其發病率高達100%，死亡率達10%[13-14]。病原菌通過病馬咳嗽、膿汁等持續向外排毒，隨后與健康馬匹接觸而被感染[15]。鼻咽拭子的微生物學和PCR篩查能夠有效鑒定是否感染SEE，也可以通過血清學方法鑒定[16-17]，此外還可以應用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測全長SeM蛋白的血清抗體來進行診斷（http://www.idexx.com/equine/laboratory/sequi elisa/），但對于亞臨床性疾病的診斷并不可靠[2]。

2.1 細菌的分離培養SEE菌株具有β溶血的特點也是初步鑒定馬鏈球菌的手段之一，40份樣品中分離出8株形態單一穩定的樣品有溶血現象，其中7株呈β溶血，1株呈α溶血（圖1）。細菌形態學觀察可知，革蘭氏染色鏡檢中6株為β溶血菌株呈藍色鏈狀排列的球菌（圖2a），而另1株為β溶血菌株呈藍色桿狀（圖2b）；α溶血的菌呈藍色鏈狀排列均為陽性（圖2c）。將1株α溶血菌和7株β溶血菌送至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行測序。通過鏈球菌生化鑒定管A203對7株呈陽性菌進行生化檢測，結果見表2和圖3。由于SEE含有溶血素，具有β溶血的特征，通過SEE不能發酵蕈糖（海藻糖）、乳糖或山梨醇，而SEZ通常能夠發酵蕈糖、乳糖或山梨醇，因此很容易區分SEE和SEZ。但使用該方法分離和鑒定馬鏈球菌非常耗時，從收到臨床樣本起至少需要48 h，而PCR技術能夠有效避免細菌生化試驗培養的不足，因此它不再是檢測馬鏈球菌或診斷馬腺疫的金標準方法[18]。本研究通過分離出的7株馬源鏈球菌是否發酵蕈糖、蔗糖或山梨醇，即可初步診斷7株菌的分型，結果只有分離株A13能夠發酵蕈糖和蔗糖，其余菌均不能發酵蕈糖即可初步診斷分離株A13為SEZ，而其余6種菌為SEE，但需PCR進一步確定和測序分析其同源性。

圖1 細菌在培養基上呈β溶血Fig.1 Bacteria were β-hemolytic on the midium

圖2 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Bacteria were β-hemolytic on the medium

圖3 分離菌的生化鑒定結果Fig.3 Biochemical characters of bacteria

2.2fneB基因擴增和同源性分析 根據表1中的fneB引物，陽性對照菌為N20，對7株疑似SEE菌株進行PCR擴增，7株菌均在1428 bp處擴增出目的條帶，回收7株菌膠回收產物連接并送測序（圖4）。

圖4 fneB基因擴增結果Fig.4 The PCR amplification of fneB gene

7株疑似SEE分離菌株源于A馬場、C馬場，對疑似的7株菌拼接后提交NCBI數據庫比對與其相似度較高的序列并進行下載，利用MegAlign的Clustal W和GenBank登錄的SEE同源性基因序列與7株分離株測序結果進行比較，其中6株菌之間的核苷酸和氨基酸同源性均高達90%～99%（圖5，圖6）；6株分離菌株與美國源馬亞種（GenBank：CP021972.1）、瑞典源馬亞種（GenBank：AY898649.2）核苷酸同源性最高，達96%～99%[9]；分離的6株菌株分別來源于A馬場的A8菌株和C馬場的C2、C6、C9、C14和C16共5株菌株，可能為SEE菌株，而另1株A馬場的A13菌株與其余6株分離株的同源性為76%～85%，用BLAST對其序列進行分析，結果表明A13菌株與SEZ（H70）菌株的序列相似度為95%，該序列（GenBank登錄號：FM204884.1），與SEE（ATCC 39506）的序列相似度為94%，該序列登錄號為（GenBank：CP021972.1）。分離的6株菌株與SEE菌株聚為一支，分離株A13先與SEZ菌株聚為一支，然后伸展與SEE菌株聚為一支，并且遺傳親緣性較近，并根據生化反應中SEZ能發酵蕈糖和蔗糖等特點，分離株A13可能為SEZ菌株，見圖7。7株分離菌株均以fneB基因為PCR靶基因，據Lannerg?rd等[8]報道，以fneB基因為目的基因進行PCR檢測，10株SEZ菌株中可以檢測到3株SEE菌株，經細菌生化試驗及PCR測序可知，A馬場分離株A8菌株為SEE菌株，A13菌株為SEZ菌株，表明該馬場的馬腺疫疾病是由SEE和SEZ混合感染引起，而C馬場分離到的5株菌C2、C6、C9、C14和C16生化反應結果及PCR檢測均符合SEE菌株特點，表明該馬場發生的馬腺疫是由SEE引起。

圖5 分離株fneB基因核苷酸同源性分析Fig.5 Isolates fneB gene of nucleic acid homology analysis

圖7 分離株fneB基因系統發育樹Fig.7 Isolates fneB gene of phylogenetic tree

2.3 血常規指標測定 為了排除干擾，選擇已經確診為鏈球菌感染患馬的血樣進行分析，與健康馬相比，患病馬的白細胞總數極顯著升高，白細胞總數升高大多數見于細菌性疾病和炎癥性疾病，如炭疽、腺疫、巴氏桿菌病、蜂窩織炎等，這與本實驗結果相符合，患病馬匹白細胞總數高于健康馬。粒細胞數和淋巴細胞數顯著升高，表明患馬腺疫時以淋巴細胞和粒細胞的增多為主。淋巴細胞是重要的免疫活性細胞，增多常見于感染性疾病、急性傳染病的恢復期及淋巴性白血病[19-20]?；疾●R的淋巴細胞數量增多推測可能與感染馬頜下淋巴組織受損破壞有關，也不排除病馬多處于恢復期而導致的淋巴細胞數量增多。單核細胞增多常見于急性感染性疾病，如結核病、布魯菌病及某些霉菌感染和大多數伴有肉芽腫性反應的疾病，也見于疾病急性感染的恢復期，推測實驗結果中單核細胞數目的升高與馬腺疫疾病恢復期、新生肉芽腫的生成有關?；疾●R與健康馬相比HCT升高，說明患病馬可能有脫水的癥狀，導致血液濃縮，常見的血液濃縮的原因包括疾病感染和發熱，馬腺疫病程中有典型、持續的體溫升高變化，可能是造成患馬HCT高于健康馬的主要原因之一。

2.4 血涂片檢查 通過血涂片檢查，可以觀察到同視野中白細胞數目明顯增加，尤其是中性粒細胞數目明顯增加（圖8A）；且出現核分葉明顯，中性粒細胞過于成熟，呈核右移的現象（圖8B）。

圖8 血涂片檢查Fig.8 Blood routine examination

本研究從新疆伊犁3個馬場中分離出了7株馬鏈球菌，通過同源性結果分析可知，其中6株為SEE菌株，而另1株為SEZ菌株，由此說明新疆伊犁地區存在SEE和SEZ的混合感染，今后需加強伊犁地區馬腺疫疫病的防控。