鐵氧化菌菌株EEELCW01的基因組分析及砷轉化功能

熊瀟然，鄒奇，吳川，夏禮兵，潘煒松*

鐵氧化菌菌株EEELCW01的基因組分析及砷轉化功能

熊瀟然1，鄒奇2，吳川3，夏禮兵1，潘煒松1*

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.華南師范大學生命科學學院，廣東 廣州 510006；3.中南大學冶金與環境學院，湖南 長沙 410083)

以從砷污染農田土壤中分離的1株鐵氧化細菌EEELCW01為研究對象，對該菌進行全基因組分析，通過GO、KEGG、COG等數據庫比對，預測該菌砷相關基因的功能；采用水培試驗，驗證該菌的砷轉化能力。結果表明：菌株EEELCW01基因組大小為4 714 242 bp，具有2條大小分別為2 065 078 bp和2 649 164 bp的染色體，GC含量為55.99%，染色體上有4588個CDS，包含58個tRNA和12個rRNA；COG數據庫注釋表明該菌基因功能主要集中在氨基酸轉運代謝、無機離子轉運代謝等過程，GO數據庫注釋表明該菌主要包含膜組成部分、氧化還原過程和相關酶活性等功能，KEGG注釋顯示代謝相關的基因占比最高；菌株EEELCW01基因組中含有多種與砷代謝相關的基因(、、、、、、和)；菌株EEELCW01將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)的能力強，有氧條件下，3 d時還原率達40.1%?？梢?，可利用該菌株促進砷的生物還原，并聯合砷超富集植物進行環境砷污染修復。

砷；鐵氧化菌；砷轉化；基因組分析；功能注釋

據估計，中國土壤中砷的平均質量分數為11.2 mg/kg，遠高于世界平均值(7.2 mg/kg)[1]。除了火山活動、巖石風化等自然因素外，礦產資源的開采、運輸、冶煉及工業廢渣和廢水排放等人為因素[2–3]均會加速環境中砷元素的釋放，從而引發不同程度的土壤砷污染。土壤砷污染在導致植物中毒、作物減產的同時，還會嚴重威脅人體健康[4]。

傳統的砷污染治理，主要基于氧化、共沉淀、過濾、吸附、離子交換等方法[5]。相對于高成本的傳統治理方法，微生物修復技術因其效果好、投資小、易于管理與操作及不產生二次污染等優點，正日益受到人們的重視，成為土壤砷污染修復的研究熱點。微生物通過改變砷的氧化還原狀態，進而改變土壤砷的離子價態及活性，使亞砷酸鹽氧化為砷酸鹽，從而降低砷的毒性。鐵氧化細菌屬于化能無機營養型菌，可以氧化Fe(Ⅱ)生成鐵的(氫)氧化物礦物，包括針鐵礦、水鐵礦、赤鐵礦、纖鐵礦和磁鐵礦等[6–9]。這些生物合成的含鐵礦物通過吸附、沉降和共沉淀等過程，可有效去除水體或土壤中的砷。具有鐵氧化能力的微生物分布較廣，在細菌域和古菌域中均有分布[10]，細菌域中主要分布在變形桿菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、硝化螺菌門(Nitrospira)和綠細菌門(Chlorobi)中，古菌域中主要分布在廣古菌門(Euryarchaeota)[11]。已經報道的砷氧化菌株屬于變形菌門中的α–、β–、γ–變形菌綱及厚壁菌門，且廣泛分布于土壤、沉積物、地下水、礦山尾礦和酸性礦山廢水及熱泉中[12–14]。研究[15]表明，三價砷的氧化、五價砷的還原外排、三價砷的甲基化外排、通過抗性蛋白扣押砷離子等機制往往由其遺傳學基礎所決定。微生物主要通過細胞膜上的甘油通道蛋白GlpF或者同源蛋白FpslP使亞砷酸鹽進入到微生物細胞內[16]，由基因編碼的ATP亞砷酸鹽轉運蛋白外排[17]。As(Ⅴ)還原機制由操縱子控制實現，主要包括構成操縱子模式的、、、、和基因[18]。前期研究從稻田土壤中篩選出1株鐵氧化菌EEELCW01，盆栽試驗結果顯示，EEELCW01可顯著降低土壤有效態As的含量[19–20]。本研究中，筆者對該鐵氧化菌進行基因組生物信息學分析及其砷轉化功能研究，闡述該菌影響砷形態轉換和環境行為的分子機制，挖掘其環境砷修復潛力，以期為建立高效、低成本的砷污染生物修復方法提供依據。

1　材料與方法

1.1　供試材料

供試鐵氧化菌菌株EEELCW01分離于湖南省長沙市芙蓉區某典型砷污染農田，其可在微好氧條件下進行亞鐵氧化。該菌在NCBI GenBank上的登錄號為CP047599，前期研究鑒定其屬于蒼白桿菌屬()[19]。

1.2　EEELCW01基因組DNA的提取及測序

將純化后的菌株EEELCW01接種到LB液體培養基，于28 ℃、150 r/min條件下培養至穩定期，采用DNA提取試劑盒(MagaBio Soil/Feces Genomic DNA Purification Kit)提取菌株的基因組DNA，DNA片段化處理后構建文庫，并送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.3　EEELCW01全基因組功能基因分析

原始測序數據運用FastQC(v0.11.8)、cutadapt (v1.18)進行質控和去接頭后獲得干凈序列；運用SOAPdenovo進行基因組組裝，運用GapCloser對組裝得到的初步結果進行補洞和堿基矯正，以獲得最終組裝結果；運用SSpace對組裝得到的Scaffolds進行拼接延伸，最終獲得組裝的EEELCW01基因組。運用CG View Server進行EEELCW01基因組圈圖繪制。

參照文獻[21–22]的方法，采用GeneMark對EEELCW01全基因組進行ORF預測，主要利用GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)數據庫并運用diamond(v0.7.9)進行基因注釋和分析。同時，將菌株EEELCW01的基因組核酸序列與砷相關基因的數據庫進行tblastx比對，得到ORF在基因組Scaffolds的坐標，從而將砷的相關基因定位到菌株的基因組中。運用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)將EEELCW01基因組的砷相關基因簇與YNTRS–40、ATCC 17100、ES–1和spAS–1進行對比，并運用TB Tools(v1.108)進行基因組共線性分析。

1.4　EEELCW01的砷形態轉化功能分析

將1 mL含有純化EEELCW01的菌液接種在體積分數為1%的重碳酸鹽緩沖體系中，在28 ℃下振蕩培養2 d后對培養液進行過濾，以去除生成的鐵沉淀物；將濾液在8000 r/min下離心10 min，收集沉淀下來的菌體，用pH 7.0的無菌去離子水洗3次后制成細菌懸浮液，富集培養。EEELCW01的砷形態轉化功能分析試驗設4個處理：T1，厭氧條件下(氮氣吹掃后密封)，同時添加富集的4% EEELCW01菌液和滅菌的1 mmol/L As(Ⅲ)溶液；T2，厭氧條件下，只添加滅菌的1 mmol/L As(Ⅲ)溶液；T3，有氧條件下，同時添加富集的4%EEELCW01菌液和滅菌的1 mmol/L As(Ⅴ)溶液；T4，有氧條件下，只添加滅菌的1 mmol/L As(Ⅴ)溶液。4種處理均在25 ℃預先紫外滅菌的恒溫培養箱中培養3 d，分別于培養1、2、3 d采樣。離心(10 000 r/min、15 min)后將各處理組的菌液和菌體分離，上清液經0.45 μm濾膜過濾，采用液相色譜(島津LC–15C)–原子熒光(吉天儀器AFS–8230)聯用儀測定As(Ⅲ)、As(Ⅴ)含量。

2　結果與分析

2.1　EEELCW01的基因組信息

EEELCW01的基因組大小為4 714 242 bp，GC含量為55.99%，其2條染色體上基因大小分別為2 065 078 bp和2 649 164 bp，共包含4588個CDS(編碼序列)。運用CGView Server繪出的EEELCW01的基因組圈圖如圖1所示。EEELCW01的基因組中含有58個tRNA和12個rRNA，EEELCW01在NR、GO、KEGG和COG數據庫中得到注釋的基因數分別為4588、3376、2479和4081個，分別占基因總數的100%、73.58%、54.03%和88.95%。

圖1　EEELCW01的全基因組圈圖

2.2　EEELCW01的基因組功能注釋結果

采用COG數據庫對基因產物進行直系同源分類發現，鑒定EEELCW01基因得到的4081個編碼蛋白可分為20個功能類別，其中大部分COG注釋的基因與細菌細胞的基本功能有關，如氨基酸轉運代謝、無機離子轉運代謝、轉錄、碳水化合物轉運代謝、細胞壁/膜/被膜生物合成、能量生成轉換等(表1)。注釋基因數量最多的為氨基酸轉運代謝(447個)，其次為無機離子轉運代謝(330個)，具備次級代謝物生物合成、轉運和代謝(Q)功能的基因共有51個，具備胞內轉運、分泌和膜泡運輸(U)功能的基因有65個，具備碳水化合物轉運代謝(G)功能的基因共有290個，表明該菌可能與重金屬離子的轉化和運輸有關。

表1　EEELCW01基因組的eggNOG/COG注釋結果

采用KEGG對EEELCW01基因組進行注釋，結果如表2所示。EEELCW01共有2479個基因分布在196種代謝通路中，與代謝相關的基因在注釋基因中的占比最高，主要包括碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、能量代謝、脂代謝、核苷酸和氨基酸代謝等。較高比例的膜轉運、輔助因子和維生素代謝等基因表明菌株EEELCW01對環境脅迫有較強的適應能力。

表2　EEELCW01基因組的KEGG注釋結果

運用GO數據庫對EEELCW01的基因組進行功能注釋，結果如圖2所示。EEELCW01的基因在生物學過程、分子功能和細胞組分3個分支中共有42類，其中ATP、DNA等結合和轉錄因子活性以及氧化還原酶、水解酶等酶活性在分子功能中發揮重要作用；膜組成部分、質膜和細胞質在細胞組分內占優勢；而氧化還原過程、轉錄調控和DNA模板、轉運和跨膜運輸等在生物學進程中表現活躍。GO注釋結果表明，EEELCW01有著復雜的代謝調控網絡，主要集中在代謝途徑。

圖2　EEELCW01基因組的GO注釋結果

綜合分析NR、GO、KEGG和COG數據庫，根據值和同源性分析發現，該菌株基因組中含有、、、、、、和等與砷代謝相關的基因(表3)。比較菌株EEELCW01和其他4種已測序的鐵氧化菌株(YNTRS–40[23]、ATCC 17100[24]、ES–1[25]及砷氧化菌sp. AS–1[26])的砷代謝相關基因簇(圖3)，發現這幾種菌株中均含有與砷抗性相關的基因和。和的多拷貝特點可能與菌株EEELCW01能夠耐受高濃度的砷及高效的砷轉化能力有關。EEELCW01和其他4株菌株的砷代謝基因簇有差異：菌株EEELCW01含有砷甲基化基因簇，而其他4種菌株沒有；菌株EEELCW01的基因簇在染色體上的順序與菌株YNTRS–40及ES–1的基因順序相反，說明不同鐵氧化菌株砷功能基因可能有不同的來源。

表3　EEELCW01基因組中砷代謝相關基因

圖3　鐵氧化菌砷代謝基因簇

2.3　EEELCW01對砷形態轉化的影響

從圖4可知，厭氧條件下，T1處理組培養液中的As(Ⅲ)濃度有略微下降，這可能是由細菌的吸附和轉化共同造成的；T1和T2的As(Ⅴ)濃度基本為0，且兩者的As(Ⅲ)濃度無明顯區別，表明在厭氧條件下該菌沒有介導砷的氧化過程。有氧條件下，T4的As(Ⅴ)濃度均無明顯變化，As(Ⅲ)濃度基本為0；T3中生成了較多的As(Ⅲ)，同時As(Ⅴ)濃度下降，隨著培養的持續進行，As(Ⅴ)濃度持續降低，3 d時，As(Ⅴ)濃度最低，下降了0.367 mmol/L，還原率為40.1%，表明在有氧條件下EEELCW01菌株也可將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)。

圖4　EEELCW01對砷的氧化還原狀況

3　結論與討論

本研究中，筆者對自湖南省長沙市芙蓉區某典型砷污染農田中分離獲得的1株蒼白桿菌EEELCW01進行了基因序列分析和砷轉化相關功能研究。結果表明，該菌株中和代謝相關的基因最多，代謝功能包括碳水化合物、核苷酸、能量和氨基酸代謝等。這和柳朝陽等[26]報道的1株砷氧化菌sp. AS–1類似。AS–1菌株同時具備氧化Sb(Ⅲ)的能力，表明對砷具有高耐受性的菌株可能具備類似的代謝途徑。菌株EEELCW01基因組中含有許多與砷代謝相關的基因，如、、、、、、和。為阻遏蛋白基因，與啟動子結合時會抑制其他基因的轉錄與表達；是載體蛋白基因，與利用膜電勢將As(Ⅲ)排出有關；基因負責編碼As(Ⅴ)還原酶，在As(Ⅴ)還原中起關鍵作用[27]。EEELCW01能將進入胞內的As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)，并由膜蛋白將As(Ⅲ)泵出，具有細胞質砷還原功能，可能就是由于該菌具有這些基因所致。前期研究[19]發現，EEELCW01為嗜中性微好氧鐵氧化菌，通過生物鐵氧化代謝產生還原型輔酶和三磷酸腺苷，并含有、、和，可耦合進行硝酸鹽和鐵代謝過程，其擁有完整的硝酸鹽還原代謝路徑。前期研究[19]還表明，EEELCW01促進了Fe(II)的氧化和亞硝酸根的還原，添加2%或更多的EEELCW01細菌可顯著去除水體中的砷，從而形成鱗鈰石和2種含砷礦物(霰石、菱鐵礦)，表明該砷耐性菌有望用于修復土壤或者水體砷污染。

本研究中，菌株EEELCW01在無氧和有氧條件下均無明顯砷氧化現象。劉瓊[28]的研究表明，在好氧及厭氧2種不同條件下，好氧sp. GE–1及厭氧Strain2002在無鐵的環境下不吸收或生物吸附As來降低砷的濃度，且不會改變As的價態。菌株EEELCW01雖具有砷氧化基因，但未體現砷氧化功能，可能是由于缺乏鐵離子導致的。環境中礦物對As(Ⅲ)的吸附性較低，而一些鐵鋁化合物對As(Ⅴ)的吸附能力較強，從而限制了As(Ⅴ)的流動性[29]，As(Ⅲ)的遷移率大于As(Ⅴ)的遷移率。菌株EEELCW01在有氧條件下仍具有較強的砷還原功能，3 d可還原0.367 mmol/L As(Ⅴ)，還原率達40.1%。在砷污染治理過程中，可通過菌株EEELCW01將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)，并與超富集砷的植物(如蜈蚣草[30])協同進行土壤砷的植物提取修復。

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Genomic analysis and arsenic transformation of iron-oxidizing strain EEELCW01

XIONG Xiaoran1，ZOU Qi2，WU Chuan3，XIA Libin1，PAN Weisong1*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510006, China; 3.School of Metallurgy and Environment, Central South University, Changsha, Hunan 410083, China)

In this study, the iron-oxidizing bacterium EEELCW01, isolated from As-contaminated soils, underwent comprehensive genome analysis. The potential function of As-related genes was assessed through comparative analysis with GO, KEGG and COG databases, while the As transformation capacity of this strain was investigated via hydroponic experiments. Results unveiled that EEELCW01 possessed a genome size of 4 714 242 bp, encompassing two chromosomes sized at 2 065 078 bp and 2 649 164 bp, respectively, with a GC content of 55.99%. The chromosomes harbored 4588 CDSs, 58 tRNAs and 12 rRNAs. COG annotation emphasized gene functions centered on amino acid transport and metabolism, as well as inorganic ion transport and metabolism. GO annotation highlighted functions such as integral membrane components, oxidation-reduction processes and related enzyme activities. KEGG annotation predominantly indicated metabolism-related genes. The strain’s genome featured multiple As metabolism-related genes, including,,,,,,and. Hydroponic experiments exhibited the strain’s robust capability to reduce As(Ⅴ) to As(Ⅲ), manifesting a reduction rate of 40.1% after 3 days of incubation. In conclusion, through promoting As bioreduction and being in combination with hyperaccumulator, the EEELCW01 could be expected to conduct for the remediation of As-contaminated environments.

arsenic; iron oxidation bacteria(FeOB); arsenic transformation; genome analysis; function prediction

X172

A

1007–1032(2023)04–0428–08

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.008

2022–05–26

2023–08–01

國家自然科學基金項目(42177392)

熊瀟然(1996—)，男，云南大理人，碩士研究生，主要從事土壤重金屬修復研究，1433859346@qq.com；*通信作者，潘煒松，博士，副教授，主要從事土壤微生物修復研究，joux19@163.com

熊瀟然，鄒奇，吳川，夏禮兵，潘煒松．鐵氧化菌菌株EEELCW01的基因組分析及砷轉化功能[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：428–435．

XIONG X R，ZOU Q，WU C，XIA L B，PAN W S．Genomic analysis and arsenic transformation of iron-oxidizing strain EEELCW01[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：428–435．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正