牛卵泡顆粒細胞CART與候選受體的分子對接及其功能

郝琴琴，任靜，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛

牛卵泡顆粒細胞CART與候選受體的分子對接及其功能

郝琴琴，任靜，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛*

(山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801)

通過同源建模預測牛卵泡顆粒細胞(GCs)可卡因–苯丙胺轉錄肽(CART)與候選受體ZMPSTE24的三維結構，運用分子對接技術分析二者的結合模式，探究其分子互作關系；選取3頭健康成年母牛，分離GCs，轉染、、、2沉默序列，提取總RNA，并采用qRT–PCR檢測TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4個候選受體沉默后mRNA的相對表達量；采用CCK–8法測定各試驗組和對照組GCs增殖情況；采用ELISA法檢測各組培養液中雌激素(E2)的質量濃度，研究此4個候選受體在牛卵泡GCs中的功能。結果表明：ZMPSTE24與CART存在1個結合位點、9個鹽橋、17個氫鍵；4個候選受體試驗組的mRNA相對表達量均極顯著(<0.01)低于siNC組和空白組的，表明、、、在GCs中沉默效果良好；、、、沉默后，各試驗組的細胞增殖率和培養液中E2質量濃度均極顯著(<0.01)低于陽性對照組(不加CART)的?？梢?，4個候選受體基因沉默后，CART對GCs增殖和E2分泌仍具有抑制作用。

牛；卵泡顆粒細胞；CART候選受體；分子對接

牛是單胎動物，通常1個發情期內有2～3個卵泡波，最終僅有1個優勢卵泡發育成熟并釋放卵子：因此，排卵卵泡的數量和質量直接影響優良種畜擴繁及胚胎工程技術的應用[1–3]。KOBAYASHI等[4]研究發現，可卡因–苯丙胺轉錄肽(CART)通過下丘腦–垂體–卵巢軸直接作用于牛卵泡顆粒細胞(GCs)，抑制促卵泡素(FSH)介導的雌激素(E2)分泌、cAMP表達，對牛卵泡發育起顯著負調控作用，是抑制卵泡優勢化的重要因子。對CART受體的研究，對單胎家畜良種擴繁和胚胎移植技術的應用具有重要意義。對提高母牛繁殖性能的研究[5–6]大多集中于超數排卵技術的應用，該技術主要在母牛發情期間，通過皮下注射FSH，使卵巢上多個卵泡發育成熟，并利用人工授精和胚胎移植技術實現優良種畜擴繁，但其在養殖戶中難以普及。前期對影響牛繁殖性能的卵泡生長發育和閉鎖機理進行了探究，發現GCs中的CART影響卵泡發育，且證實了其功能[7–9]。然而，由于CART受體立體結構復雜，抽提后蛋白質活性難以保留且易表達重組蛋白，致使牛卵泡GCs中CART的受體至今仍未被明確。VICENTIC等[10]研究發現，125I–CART61–102能與AtT20細胞特異性結合；LAKATOS等[11]認為，CART55–102可通過G蛋白偶聯受體(GPCRs)介導AtT20胞外信號調節激酶(ERK)通路，表明AtT20細胞內存在CART受體；NAGELOVá等[12]研究發現，125I–CART61–102在低濃度下能與大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞發生特異性結合。相比于超數排卵技術，通過研究CART受體，厘清牛卵泡發育機制，進而提高排卵率的方法具有成本低、效果好、風險低等優點。李鵬飛[13]通過轉錄組測序、蛋白質組學分析及同源建模等將跨膜附睪蛋白１(TEDDM1)、血管緊張素Ⅱ受體–2型(AGTR2)、趨化因子樣受體１(CMKLR1)作為CART候選受體；成俊麗等[14]通過膜蛋白抽提、親和免疫層析和Label–free蛋白質組學等技術將ZMPSTE24)作為CART候選受體，但ZMPSTE24與CART的結合關系及所有候選受體的具體功能尚不明確。本研究中，通過同源建模和分子對接技術分析ZMPSTE24與CART的互作關系，并運用RNA干擾(RNAi)技術對、、2、在牛卵泡GCs中的功能進行探討，初步分析其對卵泡生長發育的調控作用，以期為改善母牛繁殖性能提供依據。

1　材料與方法

1.1　試驗動物及樣品采集

選取3頭12月齡健康西門塔爾母牛(來自山西省文水縣肉牛屠宰場)，屠宰后摘取雙側卵巢，置于4 ℃預冷磷酸鹽緩沖液(DPBS)中，采集GCs。

1.2　方法

1.2.1同源建模和分子對接

在NCBI數據庫中分別獲取ZMPSTE24與CART的氨基酸序列，運用Discovery Studio 2019中PDB_nr95分別對二者氨基酸序列進行BLAST比對，運用MODELER搜索相似性高的X衍射晶體結構作為三維結構模型，繪制拉氏構象進行蛋白模型質量評估。

在ZDOCK中分別提交ZMPSTE24和CART的PDB文件，將RMSD Cutoff設置為6.0，Interface Cutoff設置為9.0，Maximum Number of Clusters設置為60，進行對接計算，獲取ZMPSTE24和CART的初步結合構象；運用Gromacs 2019進行動力學模擬。

1.2.2GCs分離及小干擾RNA(siRNA)細胞轉染

分離卵巢中直徑>5 mm的卵泡，經無菌DPBS清洗后置于盛有DPBS的無菌培養皿中，刮取內壁GCs，將DPBS和GCs的混合溶液轉移至離心管中，1400 r/min離心7 min，棄上清，獲取GCs，于體外培養。當細胞密度達到80%～90%時，將GCs接種于6孔板培養，每48 h更換一次培養液，培養120 h后，參照RAW siRNA轉染試劑說明書進行轉染。si、si、si、si和si序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，具體序列列于表1。

表1　siRNA細胞轉染所用siRNA序列

1.2.3總RNA提取與反轉錄及qRT–PCR反應

采用Trizol法提取各組細胞總RNA，運用核酸蛋白定量儀測定總RNA純度及濃度，合格后參照RT Reagent Kit With gDNA Eraser說明書進行反轉錄。20 μL反應體系：總RNA 10 μL、RT Primer Mix 1 μL、Primer Script RT Enzyme Mix I 1 μL、5×Primer Script Buffer 2(for Real time) 4 μL、RNase–Free ddH2O 4 μL。

從NCBI數據庫中獲取牛、、、的mRNA核酸序列，運用Primer 3.0在線設計特異性引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列列于表2。采用qRT–PCR檢測各候選受體沉默后mRNA的相對表達量。每個候選受體分別設1個試驗組，2個對照組(空白組和siNC組)，每組重復3次。以牛為內參基因，建立10 μL反應體系：cDNA 1 μL、上游及下游引物各0.4 μL、SYBR?Premix ExⅡ 5 μL、ddH2O 3.2 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循環40次。

表2　qRT–PCR檢測引物序列

1.2.4GCs增殖率與E2質量濃度的測定

設4個試驗組(si組、si組、si組和si組)和4個對照組(空白組、RFect組、siNC組和陽性組)，每組重復3次。于96孔板中進行培養，每孔中加入100 μL各組細胞懸浮液，37 ℃、5% CO2培養箱放置24 h后，參照CCK–8試劑盒說明書操作，采用酶標儀測定各組450 nm值，計算細胞增殖率。將各組細胞培養液3000 r/min離心15 min，取100 μL上清，采用ELISA試劑盒進行測定。運用ELISACalc，以標準品5000、2500、1000、500、250、0 pg/mL為橫坐標，450 nm值為縱坐標擬合標準曲線，計算各組E2質量濃度。

1.2.5統計學分析

采用2–ΔΔCt法計算各基因在牛卵泡GCs中的mRNA相對表達量，以為內參基因均一化表達水平，各基因相對表達量為2–ΔΔCt；每個試驗重復3次，運用GraphPad Prism 8.0對所有結果進行檢驗分析。

2　結果與分析

2.1　CART和ZMPSTE24模型構建結果

運用Discovery Studio 2019分別對受體ZMPSTE24和配體CART進行同源建模。結果顯示，ZMPSTE24與蛋白CAAX prenyl protease 1(PDB ID為5syt)氨基酸序列一致性達91.3%，符合建模一致性大于30%的條件：因此，以CAAX prenyl protease 1為模板建模，ZMPSTE24的立體結構如圖1–a所示。CART與蛋白Phosphoribosy lanthranilate isomerase(PDB ID為1v5x)的氨基酸序列一致性為47%：因此，以該蛋白為模板進行建模，CART的立體結構如圖1–b所示。

a、b　分別為ZMPSTE24和CART。

2.2　CART和ZMPSTE24模型評價結果

ZMPSTE24拉式構象(圖2–a)顯示，97.82%的氨基酸殘基位于允許區(綠色區域)，數值大于90%，符合立體化學能量規則，表明該模型合理；CART拉式構象(圖2–b)顯示，91.82%的氨基酸殘基位于允許區，表明該模型可靠，可進行分子對接計算。

a、b　分別為ZMPSTE24和CART。

2.3　ZMPSTE24與CART分子對接結果

對ZMPSTE24與CART對接的復合體(圖3)進行優化，結果顯示，均方根偏差(RMSD)曲線變化趨于穩定(圖4)，表明復合體結構已達到理想狀態，可進行對接分析。分析ZMPSTE24與CART的互作關系，結果顯示：ZMPSTE24與CART存在1個結合位點、9個鹽橋、17個氫鍵；結合部位CART(配體)的接觸面積、極性接觸面積、非極性接觸面積分別為5.116 8、3.114 8、2.004 8 nm2，ZMPSTE24(受體)的接觸面積、極性接觸面積、非極性接觸面積分別為5.236 6、2.890 3、2.346 2 nm2，表明ZMPSTE24可能為CART受體。

紫色示CART；綠色示ZMPSTE24。

圖4　CART–ZMPSTE24復合體的RMSD曲線

2.4　CART候選受體轉染siRNA后mRNA的相對表達情況

圖5顯示，4個候選受體試驗組的mRNA相對表達量均極顯著(<0.01)低于siNC組和空白組的，siNC組和空白組mRNA的相對表達量間的差異無統計學意義(>0.05)，這與預期的結果一致，表明、、、在GCs中沉默效果良好。

“**”示與對照組和siNC組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5　CART候選受體對GCs增殖的影響

從圖6可知，各試驗組細胞增殖率極顯著(<0.01)低于陽性對照組，與空白對照組、siNC組、RFect組的組間差異無統計學意義(>0.05)，表明、、、沉默后細胞增殖率變化不顯著。

“**”示陽性對照組與其他組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

2.6　CART候選受體對GCs中E2分泌的影響

E2質量濃度分析結果(圖7)顯示，不加CART的陽性對照組E2質量濃度極顯著(<0.01)高于si、si、si、si組，各試驗組E2質量濃度與空白對照組、siNC組、RFect組間的差異無統計學意義(>0.05)，表明各候選受體沉默后培養液E2的質量濃度無顯著變化。

“**”示陽性對照組與其他組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

3　結論與討論

本研究中，采用RNAi技術將CART候選受體、、、沉默后，CART對GCs增殖和E2分泌仍具有抑制作用。TEDDM1、AGTR2是7次跨膜螺旋的GPCRs。GPCRs胞內區域募集的G蛋白、第二信使等下游信號分子，主要通過cAMP信號通路、磷脂酰肌醇信號通路參與體內的多種生理活動[15]。研究表明，褪黑素(Mel)可抑制人卵巢顆粒細胞的凋亡和水牛卵母細胞cAMP的合成[16–17]，在體外成熟過程中補充Mel可以促進豬低品質卵母細胞的成熟，提高其囊胚率[18]，Mel還可促進牛、水牛卵母細胞體外成熟及胚胎體外發育[19–20]。這些發現表明Mel可能與TEDDM1、AGTR2存在頡頏作用，從而導致兩者在牛卵泡GCs中的功能未被檢測出來。后續可進一步在培養液中添加Mel，探究TEDDM1、AGTR2在牛卵泡GCs中的功能。蛋白翻譯后的修飾有磷酸化和糖基化等方式，CMKLR1分子中存在4個O–糖基化位點、1個N–糖基化位點和50個磷酸化位點[14]，推測磷酸化是CMKLR1蛋白翻譯后的主要修飾方式，而磷酸化影響細胞周期，進而影響CMKLR1基因功能表達鑒定。ZMPSTE24是1種金屬蛋白酶，廣泛分布于哺乳動物組織，其蛋白結構中包含1個鋅結合位點、1個三聯氨基酸殘基部分和GPCRs家族標志[21]。目前對ZMPSTE24的功能研究較少，本研究未檢測出其對牛卵泡GCs的影響，分析其原因可能為ZMPSTE24在卵泡GCs中表達量較少。

CART屬于下丘腦神經肽，其受體為典型GPCRs，在動物體內能夠調節攝食、參與神經疼痛、調控卵泡發育等?；谙嚓P神經肽受體研究方法，研究人員對CART受體展開探究。ABRAHAM等[22]利用免疫組化技術共定位發現，CART和CCK–1受體在大鼠大腦中與動物攝食相關的伏隔核吻側部、杏仁核基底部側復合體顯著表達，在缺乏CCK–1受體導致的肥胖大鼠和正常大鼠的以上區域中CART免疫反應比較發現，缺乏CCK–1受體的肥胖大鼠的免疫反應強度顯著降低，推測CART可能與CCK–1受體相互作用，調控動物攝食。YOSTEN等[23]對坐骨神經慢性收縮(DH–SC)神經性疼痛大鼠的脊髓背角進行RNA測序，發現GPR160是差異表達最大的轉錄本；利用免疫組化和免疫共沉淀技術發現CART與GPR160存在相互作用，通過大鼠靜脈注射GPR160抗體，結果顯示激酶ERK和CREB的磷酸化減弱，表明CART誘導大鼠DH–SC中GPR160介導的ERK/CREB信號通路，促進機械過敏反應發生。本研究中，采用RNAi技術對CART候選受體功能進行研究。該方法主要通過人工合成靶基因序列的dsRNA，轉染細胞后誘導對應序列mRNA特異性降解，致使特定基因表達缺失，具有高效、簡便、特異性強等特點，已被證明是目前研究哺乳動物基因功能的有效方法[24–25]。本研究中，從轉錄水平上分析CART候選受體在牛卵泡GCs中的功能，、、、沉默后，CART仍抑制GCs增殖和E2分泌，也可能是此4個候選受體本身表達豐度低，致使沉默后所起作用效果不顯著。鑒于CART受體結構的復雜性，利用過表達、肽段合成等技術進行配體–受體結合分析具有一定困難[26]，后續可采用X射線晶體衍射和熒光共振能量轉移等技術對CART受體進行深入研究。

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Molecular docking and functions of interaction between CART and candidate receptors in bovine follicular granulosa cells

HAO Qinqin，REN Jing，CHENG Junli，ZHU Zhiwei，XU Dongmei，JIA Xuechun，LI Pengfei*

(College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

The three-dimensional structure of Cocaine Amphetamine Transcription Peptide(CART) and the candidate receptor ZMPSTE24 in bovine follicular granulosa cells(GCs) were predicted using homologous modeling. The binding mode between these two molecules was analyzed through Macromolecular docking technology to explore their molecular interactions. Follicular GCs were isolated from three healthy adult cows and transfected with silenced sequences for,,and. Total RNA was extracted, and qRT-PCR was employed to assess the relative mRNA expression after silencing the four candidate receptors(TEDDM1, AGTR2, CMKLR1 and ZMPSTE24). The proliferation of GCs in both experimental and control groups was evaluated using the CCK-8 method. Additionally, the mass concentration of estrogen(E2) in the culture medium of each group was determined using the ELISA method, aiming to investigate the functions of these four candidate receptors in bovine follicular GCs. The results revealed one binding site, nine salt bridges, and seventeen hydrogen bonds between ZMPSTE24 and CART. The relative mRNA expression levels of the four candidate receptor test groups were significantly(<0.01) lower than those of the siNC group and blank group, confirming effective silencing of,,andin GCs. Following the silencing of,,and, the cell proliferation rate and E2mass concentration in the culture medium of each experimental group were significantly(<0.01) reduced compared to the positive control group(without CART). These findings indicated that even after the silencing of the four candidate receptor genes, CART continues to exert inhibitory effects on GCs proliferation and E2secretion.

bovine; follicular granulosa cells; CART candidate receptor; molecular docking

S823.3

A

1007–1032(2023)04–0461–07

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.013

2022–03–19

2023–08–06

國家自然科學基金項目(31873002)；山西省應用基礎研究計劃面上項目(20210302123380)；山西省現代農業產業技術體系建設專項

郝琴琴(1996—)，女，山西翼城人，碩士研究生，主要從事動物生殖生理研究，1571934599@qq.com；*通信作者，李鵬飛，博士，教授，主要從事動物生殖生理研究，adamlpf@126.com

郝琴琴，任靜，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛．牛卵泡顆粒細胞CART與候選受體的分子對接及其功能[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：461–467．

HAO Q Q，REN J，CHENG J L，ZHU Z W，XU D M，JIA X C，LI P F．Molecular docking and functions of interaction between CART and candidate receptors in bovine follicular granulosa cells[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：461–467．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正