甲磺酸侖伐替尼膠囊在中國健康受試者中的生物等效性研究

徐秋芳，周雨朦，徐 丹，雷程顥，朱 葉，肖大偉*

1南京正大天晴制藥有限公司 藥理臨床中心，南京 210046；2南京高新醫院I期臨床試驗研究部，南京 210031

侖伐替尼（lenvatinib）是一種小分子多靶點受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑，由日本衛材公司（Eisai Inc.）研發，2015 年2 月通過美國FDA 批準上市，商品名：Lenvima?，用于治療分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）。目前，Lenvima?已在全球50 多個國家獲批使用，2018 年國家藥品監督管理局（NMPA）批準其在中國的上市申請，商品名為樂衛瑪?。本研究以《以藥動學參數為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》[1]為依據，開展了南京正大天晴制藥有限公司研制的甲磺酸侖伐替尼膠囊的人體生物等效性試驗，藥物臨床試驗登記與信息公示平臺（http://www.chinadrugtrials.org.cn/）登記號為CTR20191379 和CTR20191382，以考察甲磺酸侖伐替尼膠囊國產制劑與進口制劑在中國健康受試者中的藥代動力學（pharmacokinetices，PK）特征，評價兩者的生物等效性及安全性。

1 材料與方法

1.1 材料和研究對象

1.1.1 藥物、試劑與儀器 參比制劑R 根據《普通口服固體制劑參比制劑選擇和確定指導原則》[2]中有關要求，首選國內上市的原研藥品。甲磺酸侖伐替尼膠囊（樂衛瑪?，規格：4 mg，批號：124709），由Patheon Inc.生產，南京正大天晴制藥有限公司購買提供。受試制劑T 甲磺酸侖伐替尼膠囊（規格：4 mg，批號：190201）由南京正大天晴制藥有限公司生產提供。侖伐替尼對照品（純度98.2%，批號：2254-067A3）、侖伐替尼-d4內標（純度94.2%，批號：3161-033A5）均為加拿大TLC 公司提供。

試劑：甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸均為液相色譜純；水為色譜用去離子水。

主要儀器：API 5000 質譜儀（美國Sciex 公司）、高效液相色譜系統（日本島津公司）、Allegra 25R 離心機（美國Beckman Coulter 公司）、XPE205 分析天平、XP205DR 微量分析天平（瑞士MettlerToledo 公司）、純水系統（Arium comfort I UV，德國Sartorius公司）、Analyst?數據采集軟件（版本1.4.21.6.3）、Watson?實驗室信息管理系統（版本7.3）。

1.1.2 受試者選擇 本研究臨床試驗部分由南京高新醫院承擔，試驗方案經南京高新醫院醫學倫理委員會批準（空腹試驗和餐后試驗倫理批件號分別為[2019]-010-02 號和[2019]-011-02 號）。所有參加試驗的受試者均簽署知情同意書。

入選標準：健康中國成年人，男女兼有，18 歲≤年齡≤45 歲；男性受試者的體重≥50 kg，女性≥45 kg，體質指數（BMI）18.5～26.0 kg·m-2；同意在篩選前14 天內至末次服藥后3 個月內無生育計劃或捐精、捐卵計劃，或試驗期間同意采取一種或一種以上的非藥物避孕措施。

排除標準：體格檢查、生命體征、實驗室檢查、病毒學檢查、心電圖檢查、胸部正位片、腹部B 超、血妊娠檢查（女性）等體檢結果異常有臨床意義者，或其他檢查及問診發現異常有臨床意義病史者；有過敏史者；尿液尼古丁檢測呈陽性者；在服用研究藥物前30 天內使用過任何藥物者；篩選前90 天內參加過其它藥物臨床試驗并服用試驗藥物者。

本研究臨床試驗采集的生物樣品由上海方達生物技術有限公司負責檢測。本研究已通過了國家藥品監督管理局藥品審評中心審核，免現場核查。

1.2 給藥方案和血樣采集

1.2.1 給藥方案 本試驗采用單中心、隨機、開放、兩周期、兩序列、雙交叉空腹/餐后狀態下生物等效性試驗設計。

入組受試者按1∶1 比例隨機分配到兩個給藥序列組，T-R 序列服藥順序為第一周期服用甲磺酸侖伐替尼膠囊受試制劑T，第二周期服用參比制劑R；R-T 序列服藥順序為第一周期服用參比制劑R，第二周期服用受試制劑T。每周期間的清洗期為10 天。

在空腹試驗中，受試者入組后在每周期服藥前1 天到臨床試驗研究部報到，隔夜空腹至少10 h 后，用240 mL 水送服相應試驗藥物1 片（4 mg）。在餐后試驗中，受試者還需要在每周期服藥前30 min 進食高脂餐[高脂（提供食物中約50%的熱量）高熱（約800～1000 千卡）飲食，高脂餐成分見表1]，30 min 內吃完高脂餐，在開始進餐后（30 ± 2）min 時用240 mL 水送服相應試驗藥物，檢查確認服藥結果。

表1 餐后試驗高脂餐組成（kcal）

1.2.2 血樣采集 空腹試驗：每周期服藥前0 h（服藥前1 h 內）和服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、8、12、15、24、48、72、96 和120 h 共18 個采血點采集受試者靜脈血，每次取血約3 mL 至含肝素鈉抗凝真空采血管中，采集后1 h 內置于預冷的離心機4℃條件下，2000×g 離心10 min。所有離心后血漿樣品于采血后2 h 內轉移至（-40±5）℃冰箱暫存并在24 h 內轉移至-60°C 以下冰箱儲存。

餐后試驗：每周期服藥前0 h 和服藥后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、12、15、24、48、72、96 和 120 h共18 個采血點采集受試者靜脈血，血樣處理同前。

1.3 血樣測定方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters，型號Xbridge?C1850 mm×4.6 mm，粒徑3.5 micron；柱溫：室溫；流速：1 mL·min-1；流動相為含0.1%甲酸和5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液（A）及95%（v/v）乙腈水溶液（B）；梯度洗脫（A∶B）：0.01 min（70∶30）→1.50 min（55∶45）→1.55 min（5∶95）→2.20 min（5∶95）→2.25 min（70∶30）；運行時間：3 min；進樣量：10 μL。

1.3.2 質譜條件 離子源：TurboIonSpray?，正離子模式；掃描方式為質譜多反應監測（MRM）；侖伐替尼和內標侖伐替尼-d4去集束電壓均為200 V，碰撞能量分別為38 V 和52 V；侖伐替尼用于定量分析的離子對為m/z 427.3→370.1，內標離子對為m/z 431.3→370.1。

1.3.3 標準曲線血漿樣品和質控樣品配制 標準曲線血漿樣品：取適量侖伐替尼標準品，精密稱定，用適量的甲醇溶解配制成500 μg·mL-1的標準儲備液，以50%甲醇水溶液（v∶v）將標準儲備液稀釋至150 μg·mL-1的標準中間溶液。將標準中間溶液稀釋成濃度分別為6.00、12.0、60.0、240、600、1200、4800、6000 ng·mL-1的標準工作液樣品；用血漿稀釋標準工作液至濃度分別為0.300、0.600、3.00、12.0、30.0、60.0、240、300 ng mL-1的標準曲線血漿樣品。

質控樣品：取侖伐替尼標準品，精密稱定，用適量的甲醇溶解配制成500 μg·mL-1的質控儲備液，以50%甲醇水溶液將質控儲備液稀釋成150 μg·mL-1的質控中間溶液。將質控中間溶液稀釋成濃度分別為6.00、18.0、750、4500 ng·mL-1的質控工作液；用血漿稀釋質控工作液至濃度分別0.300、0.900、37.5、225 ng mL-1的質控樣品。

1.3.4 血漿樣品處理 待測生物樣品室溫融化后，渦旋混勻，向96 孔板中加入50.0 μL 樣品（待測生物樣品、標準曲線樣品、質控樣品）；對于雙空白樣品和零點樣品，加入50.0 μL 空白人血漿。除雙空白樣品加入50.0 μL 50%甲醇水溶液外，其余樣品中加入50.0 μL 內標工作溶液（30.0 ng·mL-1）。向所有樣品中加入400 μL 沉淀劑乙腈，漩渦10 min（1000 r·min-1），6000×g 離心10 min。移取100 μL 上清液于另一96 孔板中，加入500 μL 30%乙腈水溶液復溶，渦旋振蕩5 min，6000×g 離心5 min 后，進樣分析。

1.4 統計分析方法

采用Phoenix WinNonlin 軟件（Certara USA Inc，8.2 版本）進行非房室模型藥代動力學參數的估算分析，計算侖伐替尼主要藥代動力學參數（Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2），以全面反映藥物在人體內吸收、分布、代謝和排泄的特點。Cmax、AUC0-t、AUC0-∞經自然對數轉換后以多因素方差分析（ANOVA）進行顯著性檢驗。采用SAS 軟件（9.4 版本）計算90%CI 的統計分析方法來評價受試制劑與參比制劑的生物等效性。當受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比的90%CI 都在80.00%～125.00%等效區間內，則認為兩制劑生物等效。

2 結果

2.1 受試者入組及完成情況

空腹試驗入組28 例受試者，按方案要求全部完成試驗。年齡18～45 歲；男性17 例，女性11 例；平均身高（163.1±9.1）cm；平均體重（60.0±8.7）kg；平均BMI（22.5±1.9）kg·m-2。

餐后試驗入組28 例受試者，按方案要求全部完成試驗。年齡19～45 歲；男性17 例，女性11 例；平均身高（165.5±6.7）cm；平均體重（62.8±8.8）kg；平均BMI（22.9±2.3）kg·m-2。

2.2 方法學評價

2.2.1 標準曲線與定量下限 侖伐替尼標準曲線的樣品濃度分別為0.300、0.600、3.00、12.0、30.0、60.0、240、300 ng·mL-1，所得侖伐替尼回歸方程為Y=5.60×10-2X+1.36×10-3（r2=0.998 9）。結果表明，侖伐替尼血藥濃度在0.300～300 ng·mL-1范圍內線性關系良好，其定量下限為0.300 ng·mL-1。

2.2.2 選擇性 侖伐替尼與其內標侖伐替尼-d4的保留時間均約為1.0 min，色譜峰峰形良好。本方法測定人血漿中侖伐替尼的選擇性良好，血漿基質對測定無干擾。

2.2.3 基質效應 選擇6 個不同批次的基質中，侖伐替尼低、中、高濃度（0.900、37.5、225 ng·mL-1）下，經內標校正后的平均基質因子為1.00～1.01，精密度≤2.0%；內標濃度為30.0 ng·mL-1時，經待測物校正后的平均基質因子為1.00，精密度為2.0%，符合基質效應考察的要求（≤15.0%）。

2.2.4 準確度和精密度 4 個濃度質控樣品（0.300、0.900、37.5、225 ng·mL-1）的批內精密度≤3.9%，準確度偏差為-5.9%～-0.8%；批間精密度≤3.2%，準確度偏差為-3.7%～-1.8%，定量下限濃度水平（0.300 ng·mL-1）的質控樣品檢測結果的批內和批間精密度均≤9.3%，批內準確度偏差為-15.0%～-3.3%，批間準確度偏差為-8.3%。質控樣品的批內和批間的精密度和準確度良好。

2.2.5 提取回收率 3 個濃度質控樣品（0.900、37.5、225 ng·mL-1）的回收率分別為101.7%、96.3%、96.8%，相對標準偏差≤4.9%。內標侖伐替尼-d4濃度為30.0 ng·mL-1時，回收率為102.7%，相對標準偏差≤1.8%。血樣中侖伐替尼的平均提取回收率接近100%，內標提取回收率較高，相對標準偏差均＜15%。

2.2.6 穩定性 侖伐替尼血漿樣品可在室溫下穩定18 h、可在-20°C 下穩定6 天、可5 次凍融（-70°C/室溫）循環穩定、可在-70°C 下穩定74 天；血漿樣品處理后的上清液在自動進樣器中室溫下穩定120 h，之后與原隨行標準曲線樣品再次進樣，其結果可重現。

2.3 藥代動力學研究結果和生物等效性分析

2.3.1 藥代動力學參數 中國健康受試者空腹和餐后單次口服4 mg 受試制劑和參比制劑后血漿中侖伐替尼的PK 參數見表2，血藥濃度-時間表見表3 和表4，血藥濃度-時間曲線見圖1 和圖2。

圖1 空腹口服T 與R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間曲線圖

圖2 餐后口服T 與R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間曲線圖

表2 空腹和餐后狀態下侖伐替尼的PK 參數（n=28，±s）

表2 空腹和餐后狀態下侖伐替尼的PK 參數（n=28，±s）

注: *tmax用中位數（最小值，最大值）表示

表3 健康受試者空腹口服4 mg T 或R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間表（ng·mL-1，±s）

表3 健康受試者空腹口服4 mg T 或R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間表（ng·mL-1，±s）

表4 健康受試者餐后口服4 mg T 或R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間表（ng·mL-1，±s）

表4 健康受試者餐后口服4 mg T 或R 后侖伐替尼的平均血藥濃度-時間表（ng·mL-1，±s）

2.3.2 生物等效性評價 受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均數比值的90%CI 均在80.00%～125.00%內，即本試驗兩制劑在空腹和餐后給藥狀態下均具有生物等效性，統計分析結果詳見表5。

表5 甲磺酸侖伐替尼膠囊受試制劑和參比制劑生物等效性結果

2.4 安全性評價

空腹試驗中，服用試驗藥物的28 例受試者均納入安全性評價，共有7 例受試者發生8 例次不良事件，無導致退出試驗的不良事件和嚴重不良事件發生。服用受試制劑后，4 例受試者發生4 例次不良事件，其中1 例受試者發生1 例次不良反應（鼻衄）；服用參比制劑后，3 例受試者發生4 例次不良事件，其中1 例受試者發生1 例次不良反應（結合膽紅素升高）。試驗過程中有1 例受試者在采集樣本時發生暈厥（服用參比制劑后，嚴重程度3 級），癥狀、體征：給藥后采集48 h 血樣時，受試者出現頭暈、惡心、冒冷汗，隨即暈倒，暈倒后神志即恢復，查生命體征平穩，平臥休息5 min 后受試者訴已無不適，且該受試者于第二周期服藥前埋留置針時出現對操作恐懼不良事件，癥狀、體征：惡心、嘔吐、冒冷汗，休息2 min 后好轉，經研究者判定，兩次不良事件發生癥狀類似，且暈厥不屬于本品已知的不良反應，未用藥處理后即恢復正常，因此判斷該不良事件與研究藥物可能無關。其余所有不良事件嚴重程度均為1 級（參考CTCAE 5.0 標準[3]）。試驗中所有不良事件的結果均為已恢復/已解決，無不良事件加重情況發生。

餐后試驗中，服用試驗藥物的28 例受試者均納入安全性評價，共有13 例受試者發生18 例次不良事件，無導致退出試驗的不良事件和嚴重不良事件發生。服用受試制劑后，7 例受試者發生8 例次不良事件，其中2 例受試者發生2 例次不良反應，為中性粒細胞計數降低和腹痛，其中腹痛體征：給藥后約8 h 出現臍周隱痛，隨后即有便意，排便后腹痛稍緩解，約20 min 后受試者腹痛癥狀消失；服用參比制劑后，8 例受試者發生10 例次不良事件，其中3 例受試者發生3 例次不良反應，為腹瀉、血促甲狀腺激素升高和血壓升高。試驗過程中有1 例受試者發生過敏性皮炎（服用參比制劑后，嚴重程度2級），癥狀、體征：自述使用了賓館提供的沐浴露洗澡后出現紅斑、騷癢癥狀，既往有用賓館沐浴露洗澡后出現類似癥狀的情況，予注射抗過敏藥物后緩解。次日部分紅斑已消退，考慮對洗浴產品物質過敏，建議其藥物治療，受試者拒絕藥物治療，第三日過敏癥狀自行消失，未用藥處理后恢復正常，研究者判斷該不良事件與研究藥物可能無關。其余所有不良事件嚴重程度均為1 級。試驗中所有不良事件的結果均為已恢復/已解決或緩解。

本研究均無嚴重不良事件發生，空腹或餐后狀態下單次口服甲磺酸侖伐替尼膠囊（4 mg）的安全性良好。

3 討論

本次臨床研究采用LC-MS/MS 測定人血漿中侖伐替尼濃度，分析方法學線性范圍為0.3～300 ng·mL-1，線性關系良好；采用成本較低、操作簡單的蛋白沉淀法；使用與待測物有相同理化性質的同位素內標，保留行為和離子化行為與待測物基本一致，避免了基質效應、回收率差異大等導致檢測結果不可靠的情況出現。本研究建立的分析測定方法靈敏度高、選擇性好。

本研究中受試制劑和參比制劑的各PK 參數基本接近，兩制劑的PK 特征相似，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比值的90%CI 均在80.00%～125.00%區間內，表明本試驗受試制劑與參比制劑生物等效。在原研品種食物對PK 影響的研究中[4]，食物會導致侖伐替尼的吸收速率降低（中位tmax從2 h 延遲到4 h），吸收程度略降低（Cmax比空腹狀態下的低13.5%）。本研究餐后試驗比空腹試驗tmax增加3～10 h，Cmax降低約36.5%，與原研品種研究結果趨勢相似。

本研究中服用受試制劑或參比制劑后發生的不良事件例次略有差異，但不良反應類型與樂衛瑪?說明書（2018 版）[5]中治療期間最常見的不良反應（出血事件、血膽紅素升高、腹痛、腹瀉、中性粒細胞減少癥、甲狀腺功能減退癥、高血壓等）類型基本一致，未發生非預期不良反應。綜上所述，中國健康受試者空腹和餐后狀態下單次口服甲磺酸侖伐替尼膠囊4 mg 受試制劑與參比制劑具有生物等效性，且安全性良好。

本研究與宋浩靜等[6]開展的“甲磺酸侖伐替尼膠囊隨機開放兩周期交叉生物等效性研究” 相比，詳細描述了液相色譜串聯質譜測定人血漿中侖伐替尼濃度的方法學評價內容，為同類品種的檢測可提供參考。XU Z 等[7]開展的研究使用試驗藥品規格是10 mg，本研究使用的試驗用藥品規格是4 mg，根據在中國批準上市的原研樂衛瑪?規格為4 mg，本研究為4 mg 規格藥品的臨床使用提供藥動學和安全性參考。

口服給藥后，侖伐替尼被快速吸收，通常在給藥后1～4 h 觀察到tmax。食物不影響吸收程度，但可減緩吸收速度。當與食物同服時，健康受試者的血漿濃度達峰時間延遲2 h[5]。原研品種食物對PK 影響的研究中[4]，空腹tmax范圍為2.00～4.02 h，餐后tmax范圍為4.00～8.02 h。為了捕捉Cmax濃度，空腹試驗在2～4 h 左右設計的采樣時間點比較密集，而餐后試驗在4～8 h 設計的采樣時間點相對空腹試驗更密集，這樣能獲得符合不同進食狀態下真實暴露量的數據。

甲磺酸侖伐替尼膠囊單劑量空腹、餐后狀態下給藥，中國健康人體生物等效性研究報道較少，本研究全面概述了分析方法建立、生物等效性臨床試驗過程，藥代動力學結果、生物等效性及安全性結果可為侖伐替尼人血漿濃度檢測及臨床應用的安全性、有效性提供一定的參考。本品也可為肝細胞癌患者同品種替代用藥提供更多選擇。