基于功效關聯的蒼術質量標準研究

余國鑫，李子璐，陳 君

中國藥科大學 中藥學院生藥學系，南京 210009

中藥的質量是其發揮臨床療效的根本，客觀評價和有效控制中藥質量對于其臨床應用具有重要意義[1]。中藥的傳統功效是藥材中與功效相關的活性成分在體內發揮復雜生物作用的整體體現[2]。為建立符合中藥作用特點的質量標準，應根據中藥的傳統功效對其關聯成分進行辨識和質量控制，從而合理保證中藥的臨床療效。

中藥蒼術為菊科蒼術屬植物茅蒼術Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖[3]，為常用大宗藥材，其主要成分為揮發油、萜類和糖苷類等[4]。蒼術主要傳統功效為“燥濕健脾”[5]，主要治療脾虛所致的“濕阻中焦”[6]，平胃散就是以蒼術為君藥的燥濕和胃經典方?！皾褡柚薪埂痹谂R床上主要表現為水液代謝障礙，濕即水也，“治濕不利小便，非其治也”[7]，因此，蒼術“燥濕健脾”的功效與其利尿作用密切相關。

2020 年版《中國藥典》蒼術的含量測定項下僅規定蒼術素的含量作為單一評價指標[3]，與臨床療效相關性不強，還存在道地藥材茅蒼術中蒼術素含量較低難以達到藥典要求，導致其使用受限問題[8]?；诖?，本文針對蒼術的利尿作用進行研究，篩選其利尿作用的有效部位，建立了與功效相關指標性成分的含量測定方法，以期為蒼術的質量標準提升提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；萬分之一電子天平、十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）等。

1.2 藥品與試劑

β-桉葉醇對照品、蒼術素對照品和蒼術酮對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%；購自不同產地的11 批茅蒼術（M1～M11）及11 批北蒼術（B1～B11），均經本文通訊作者鑒定。

氫氯噻嗪（山西云鵬醫藥集團有限公司）；Na+、K+、Cl-檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；0.9% NaCl 注射液（安徽雙鶴藥業有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海國藥集團化學試劑有限公司。乙腈和甲醇均為色譜純（美國天地有限公司）；水為超純水。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠（體重200～220 g）購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：20211231Aazz0619000256，于中國藥科大學動物實驗中心進行實驗，所有操作遵循《江蘇省實驗動物管理條例》 的相關規定以及倫理保護協會章程，倫理號：2021-12-024。

2 方法與結果

2.1 蒼術的利尿作用研究

2.1.1 蒼術各部位的制備 蒼術揮發油部位的制備：蒼術藥材干燥、粉碎，過三號篩后混合均勻，稱取100 g 藥材粉末，以1∶12 的料液比，采用《中國藥典》2020 版四部揮發油測定法（2204）甲法提取揮發油，收集并記錄體積，于4℃儲存備用。按照（揮發油體積/藥材質量）×100%計算揮發油提取率為1.33%。

蒼術剩余部位制備：過濾提取完揮發油的剩余蒼術藥液，收集濾液待用。藥渣采用10 倍量的80%乙醇加熱回流提取90 min，稍冷后過濾。合并兩次濾液，減壓濃縮、冷凍干燥后即得蒼術剩余部位，稱重，保存于陰涼干燥處，備用。按照（剩余部位質量/藥材質量）×100%計算剩余部位提取率為42.43%。

蒼術總提物制備：取同等生藥量下的蒼術揮發油和剩余部位混合，即得。

2.1.2 水鈉潴留大鼠模型的建立、分組及給藥劑量設置 雄性SD 大鼠適應性飼養一周后禁食不禁水18 h，輕壓大鼠下腹排盡膀胱內尿液后，以25 mL·kg-1的劑量灌胃給予去離子水，隨后立即置于代謝籠中，記錄2 h 內的尿液體積，選取2 h 排尿量超過灌胃量40%的大鼠作為后續實驗動物。將選出的大鼠隨機分為5 組，包括模型組、氫氯噻嗪組、蒼術總提物組、揮發油組和剩余部位組，每組8 只。按10 mL·kg-1的劑量灌胃給藥，連續給藥6 天。參考《中國藥典》中蒼術的成人每日最大用藥劑量9 g[3]和前期預實驗結果，選擇臨床最大使用劑量的4 倍給藥，根據體表面積折算大鼠與人的等效劑量6.3∶1，按揮發油和剩余部位的提取率計算，蒼術揮發油組和剩余部位組的給藥劑量分別為43 μL·kg-1和1.4 μg·kg-1，蒼術總提物組按上述劑量同時給予揮發油和剩余部位兩部分樣品。氫氯噻嗪組按10 mg·kg-1的劑量給藥，模型組給予等量0.5% CMC-Na。第6 天實驗前禁食不禁水18 h，以50 mL·kg-1的劑量對大鼠灌胃0.9% NaCl 溶液建立水鈉潴留大鼠模型，間隔30 min 后灌胃給藥。

2.1.3 尿液收集及試劑盒檢測 末次給藥后，輕壓下腹排盡膀胱內尿液，隨后置于代謝籠中，每隔1 h收集一次尿液并記錄單小時尿量，共5 次，最后一次收集前輕壓大鼠下腹排盡膀胱內尿液，計算給藥后各組大鼠5 h 內的總尿量。采用離子檢測試劑盒處理后用酶標儀測定尿液中Na+、K+和Cl-水平。

2.1.4 各組大鼠尿量比較 實驗結果見表1 和圖1。從單小時尿量來看，與模型組相比，蒼術總提物組和揮發油組大鼠尿量在給藥后第2 h 和第3 h 顯著增加（P ＜0.001），而剩余部位組的各時段尿量均無顯著差異（P ＞0.05）。從5 h 內總尿量結果來看，蒼術總提物組和揮發油組的總尿量較模型組顯著增加（P ＜0.001），且總提物組和揮發油組的總尿量增加程度相當，而剩余部位組較模型組無明顯差別。以上結果表明，蒼術總提物和揮發油具有利尿作用，且揮發油的利尿作用與總提物相當，表明揮發油為蒼術發揮利尿作用的活性部位。

圖1 各組大鼠0～5 h 各時間段尿量及5 h 內總尿量柱狀圖（n=6）

表1 各組大鼠0～5 h 各時間段尿量及5 h 內總尿量（n=6，mL，±s）

表1 各組大鼠0～5 h 各時間段尿量及5 h 內總尿量（n=6，mL，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001

2.1.5 尿液電解質離子濃度比較 各組大鼠尿液中的電解質離子濃度見表2。與模型組相比，蒼術總提物組和揮發油組大鼠尿液中Na+和Cl-的含量顯著增加（P ＜0.05），尿液中的K+濃度無明顯變化，而剩余部位組大鼠尿液的Na+、K+和Cl-含量較模型組均無顯著變化（P ＞0.05）。結合大鼠尿量比較結果，推測蒼術揮發油部位增加大鼠尿量的作用可能與促進Na+和Cl-的排泄有關。

表2 各組大鼠尿液電解質離子濃度（n=6，mmol·L-1，±s）

表2 各組大鼠尿液電解質離子濃度（n=6，mmol·L-1，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；純水為流動相A，乙腈-甲醇（5∶1）為流動相B，線性梯度洗脫（A∶B）：0 min（35∶65）→37 min（35∶65）→42 min（20∶80）→57 min（20∶80）→60 min（8∶92）；流速1.0 mL·min-1；柱溫20℃；進樣體積5 μL；檢測波長215 nm。

2.2.2 溶液的配制 對照品溶液：分別稱取β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含β-桉葉醇4.88mg、蒼術素0.32mg 和蒼術酮1.91mg 的混合對照品溶液，于4℃下保存備用。

供試品溶液：稱取藥材粉末約1.0 g（過三號篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，加密封塞后稱重，超聲30 min（250 W，30 kHz，35℃），取出，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，以13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液。

空白溶液：以100%甲醇作為空白溶液。

2.2.3 樣品含量測定 取樣品粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄各成分的峰面積并代入標準曲線方程中得到濃度后，根據公式（供試品溶液濃度×稀釋倍數/稱樣量）×100%計算含量。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 系統適應性與專屬性考察 取“2.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果見圖2。供試品溶液中的β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮與各對照品峰均得到指認，分離度均大于1.5，各成分理論塔板數均大于10 000，表明該方法系統適應性和專屬性良好。

圖2 空白溶液（A）、對照品溶液（B）及供試品溶液（C）HPLC 色譜圖

2.2.4.2 線性與范圍 取“2.2.2”項下混合對照品儲備液，分別稀釋1、2、4、8、16、32、128 倍，得到系列不同濃度的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，計算回歸方程以及相關性系數（表3）。結果表明，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮在各自線性范圍內線性關系良好。

表3 三個成分的標準曲線、線性范圍、定量限（LOQ）及檢測限（LOD）

2.2.4.3 精密度試驗 日內精密度：取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件在同一天內連續進樣6 次，記錄β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的峰面積。結果β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的峰面積RSD 分別為0.25%、0.27%和0.26%，表明儀器的日內精密度良好。

日間精密度：取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件每天進樣3 次，連續進樣3 天，記錄β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的峰面積。結果β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮峰面積的RSD 分別為0.37%、0.28%和0.21%，表明儀器的日間精密度良好。

2.2.4.4 穩定性試驗 稱取M7 樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、8、16、24 h 進樣測定，記錄β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的峰面積。結果β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮峰面積的RSD 分別為0.53%、0.31%和1.87%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.4.5 重復性試驗 稱取6 份M7 樣品每份約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下樣品含量測定方法進樣測定，計算含量及其RSD 值。結果顯示，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量的RSD 分別為1.83%、1.64%和2.14%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.6 加樣回收率考察 稱取6 份已知含量的藥材粉末（M7），每份約0.5 g，精密稱定后加入一定量的混合對照品，按“2.3”項下方法進樣分析并計算測得量，測得量和各待測物含有量之差與加入對照品量的比值即為加樣回收率。結果顯示，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的平均加樣回收率分別為101.92%、99.43%和99.84%，RSD 在1.36%～2.86%之間，表明該分析方法的準確性良好。

2.2.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 9 軟件對動物實驗數據進行One-Way ANOVA 分析，對含量測定數據進行t 檢驗，SPSS 23.0 軟件進行層次聚類分析。

2.2.6 含量測定與統計學分析結果 11 批茅蒼術和11 批北蒼術的含量測定結果見表4 及圖3。結果顯示，茅蒼術與北蒼術中β-桉葉醇的含量具有顯著性差異（P ＜0.001），表明β-桉葉醇為二者的主要差異性成分，可用于區分茅蒼術與北蒼術；茅蒼術與北蒼術中蒼術素與蒼術酮的含量無明顯差別，但三種成分的總量有顯著性差異（P ＜0.001），茅蒼術三種成分的總量明顯高于北蒼術。采用SPSS 23.0 軟件，以三種成分的含量為變量，采用Between-groups linkage 方法，選擇Squared Euclidean distance 為距離測度，進行層次聚類分析（圖4），結果顯示22 批蒼術樣品呈明顯的分類趨勢，當歐氏距離為15 時，茅蒼術和北蒼術各自聚為一類，表明此含量測定方法可用于區分茅蒼術與北蒼術。

圖3 茅蒼術與北蒼術中β-桉葉醇含量（A）及總量（B）比較

圖4 層次聚類分析結果

表4 蒼術中3 種成分的含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 蒼術利尿作用活性評價與含量測定指標選擇

目前《中國藥典》中蒼術的含量測定指標單一，且與蒼術的傳統功效關聯度不高，因此，本文從蒼術的傳統功效出發，對其功效相關活性部位進行研究并從中篩選含量測定指標性成分，以建立蒼術功效相關的質量標準。

“燥濕”為蒼術的重要功效，而“濕阻中焦”是其所對標的癥候。中醫理論認為“濕阻中焦”即濕邪阻于脾胃，是由于脾臟功能失調、水液運化障礙引起的，現代研究表明濕阻中焦會導致抗利尿激素上升、小便量減少、對NaCl 的重吸收增加，從而引起水鈉潴留[7，9]，而尿液是人體排出多余水分的主要形式，因此利尿是蒼術“燥濕”功效的主要表現。通過構建大鼠水鈉潴留模型，對蒼術中總提物、揮發油和剩余部位的利尿作用進行評價，結果顯示蒼術總提物和揮發油均可顯著增加水鈉潴留大鼠的尿量，且二者利尿作用相當，而剩余部位無此作用，推測揮發油為其發揮利尿作用的有效部位，其作用可能與抑制Na+和Cl-的重吸收有關。有研究表明β-桉葉醇、蒼術酮和蒼術素是蒼術揮發油部位中含量較高的成分[10]，β-桉葉醇、蒼術酮和蒼術素均報導有利尿作用，其中β-桉葉醇和蒼術酮為Na+-K+-ATP酶抑制劑，可抑制腎臟中水和Na+的重吸收產生較強的利尿作用[11，12]。因此，本研究選擇了蒼術揮發油中的β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮三種成分作為“燥濕”功效相關的活性成分建立含量測定方法。

3.2 含量測定方法的優化

3.2.1 提取條件的優化 以β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的含量為考察指標，考察了不同提取溶劑（50%、75%、100%甲醇，50%、75%、100%乙醇）、不同提取方法（超聲提取、加熱回流）、不同提取時間（15、30、60 min）和不同料液比（1∶25、1∶50、1∶100）對樣品的處理效果，結果確定了以1∶25 的料液比，100%甲醇超聲處理30 min 為最佳提取條件。

3.2.2 色譜條件的優化 以β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的分離度和峰形為考察指標，考察了不同有機相[甲醇、乙腈、乙腈∶甲醇（5∶1）]、柱溫（20、25、30℃）、進樣量（5、10、15 μL）、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）和檢測波長（205、210、215、220 nm），結果顯示，在流動相純水-乙腈∶甲醇（5∶1）、柱溫20℃、流速1.0 mL·min-1、進樣量5 μL、波長215 nm 檢測條件下，各成分的分離度和峰形較好，基線更為平穩。

3.3 含量測定結果討論

傳統認為茅蒼術為蒼術的道地藥材。11 批茅蒼術和11 批北蒼術中蒼術素的含量測定結果顯示，北蒼術中蒼術素的含量普遍高于茅蒼術，如以《中國藥典》規定的蒼術素含量指標（≥0.30%）評價，北蒼術的合格率為81.82%，而茅蒼術的僅為18.18%，這也與文獻報道因茅蒼術中蒼術素含量較低而難以達到藥典要求的問題一致[13]，顯示出現行質量標準在執行中存在與市售藥材實際不相適應的矛盾。統計學分析結果表明，茅蒼術與北蒼術中β-桉葉醇的含量和三種成分總量具有顯著性差異，通過聚類分析可將二者完全區分開來，且茅蒼術三種成分的總量明顯高于北蒼術。以這三種成分的總量為蒼術含量測定的指標更能全面反映蒼術質量，測定結果也與茅蒼術為道地藥材的傳統觀點一致。

目前茅蒼術的資源較北蒼術少[14]，價格更高。茅蒼術在性狀上與北蒼術的重要區別之一為茅蒼術斷面能析出白色細針狀結晶[3]，俗稱“起霜”，課題組前期對茅蒼術白霜的化學成分進行了分析，發現其主要成分為β-桉葉醇。傳統經驗認為茅蒼術的質量要優于北蒼術，課題組前期研究也發現茅蒼術的揮發油含量顯著高于北蒼術，有報道稱二者的揮發油組成亦有不同[15]，且藥效學實驗表明茅蒼術對大鼠濕阻中焦模型的干預作用要強于北蒼術[16]，表明二者的藥效可能存在一定的區別，有必要在質量控制中對茅蒼術和北蒼術進行區分，本文研究結果表明以β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮三種成分總量為指標的含量測定結果可反映出蒼術的兩個不同基原在傳統鑒別上的區別，對蒼術的基原鑒定和臨床應用有一定的實際應用價值。