高品質低聚木糖對小鼠腸道菌群及免疫功能影響的研究

張慶明，徐云燕，賈 佳，潘海娟，張 平

東部戰區總醫院 藥劑科,南京 210002

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）是由2～7個木糖分子通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的一種低聚糖[1],對酸熱穩定性良好，能被腸道中的雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌利用，而難以被有害微生物如葡萄球菌、腸球菌和梭狀芽孢桿菌等利用[2-4]。雙歧桿菌等益生菌代謝低聚木糖會產生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。這些短鏈脂肪酸不僅能為腸黏膜細胞提供能量，促進細胞的生長代謝，還能降低腸道內的pH 值，抑制有害菌的生長[5]；此外，SCFAs 還與促進鈣的吸收和脂質代謝、防治心血管疾病和減少結腸癌的風險等多種生理功能密切相關[6]。

目前主要是通過微生物來源的木聚糖酶水解秸稈、玉米芯等農業廢棄物中提取木聚糖來生產低聚木糖[7]，但經木聚糖酶水解制備的低聚木糖是一種由木糖到木七糖組成的復雜混合物。研究表明，木二糖和木三糖比其他木寡糖對益生菌具有更高的增殖活性[8]，但由于利用分離純化手段從性質相近的低聚木糖混合物中獲得高純度的木二糖、木三糖步驟多、難度大，因此目前多數研究仍集中在低聚木糖混合物對益生菌的增殖作用及其機制方面，缺乏高木二糖、木三糖含量的低聚木糖（HXOS）與普通低聚木糖產品（RXOS）作用的對比研究。因此，本實驗首先通過體外培養研究HXOS 對幾種益生菌生長的影響，并進一步研究其對小鼠內腸道菌群數量、SCFAs 含量及免疫功能的影響，為高品質低聚木糖的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF 級的BALB/C 雄性小鼠60 只，6～8 周齡，18～22 g，由浙江醫學院提供[生產證許可號：SCXK（浙）2019-0002]，飼養室溫度20℃～25℃，相對濕度40%～60%。普通低聚木糖產品購自山東龍力生物科技有限公司，純度95%，其中木二糖+木三糖+木四糖含量為65%。高品質低聚木糖由南京工業大學提供，純度96%，其中木二糖+木三糖含量為98%。雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌和產氣莢膜菌分別采用BBL 培養基、MRS 培養基、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基、EMB 培養基和TSC 培養基，上述培養基均購自青島海博生物技術有限公司。長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum 1.218 6）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis 1.219 0）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum 1.185 6）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii 1.875 0）均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。該方案經江蘇省藥物研究所動物管理與使用委員會批準（批準號：LL-20200507-01）。本文的實驗場所為東部戰區總醫院藥劑科制劑室的實驗室。

1.2 不同品質的低聚木糖對雙歧桿菌和乳桿菌生長的影響

在BBL 培養基或MRS 培養基中分別加入0、0.5%和1%的普通低聚木糖和高品質低聚木糖，以不添加低聚木糖的作為空白對照組，每組三個重復，121℃滅菌后分別加入長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌或植物乳桿菌和德氏乳桿菌，37℃厭氧培養48 h后，利用平板計數法測活菌數[9]。

1.3 受試小鼠分組及飼喂劑量

將小鼠隨機分成低聚木糖（普通級和高品質）低劑量組和高劑量組及空白對照組，每組12 只。由于低聚木糖的人體推薦劑量（60 kg）為0.7～1.4 g·（kg·bw）-1，因此選取1.2 g·（kg·bw）-1作為參考劑量，設計其5 倍和10 倍添加量作為低聚木糖的低劑量組[100 mg·（kg·bw）-1]和高劑量組[200 mg·（kg·bw）-1]。以0.2 mL 每日灌胃1 次，連續14 d，空白對照組灌胃等量蒸餾水。

1.4 小鼠腸道菌群的計數

在給予低聚木糖前和14 d 后，無菌采集小鼠糞便，稱重后（約0.5 g）加入4.5 mL 無菌生理鹽水中，充分振蕩混勻后靜置5 min，采取10 倍梯度稀釋上清液至10-6。將稀釋液分別接種在BBL 培養基、MRS培養基、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基、EMB培養基和SMAC 培養基上。雙歧桿菌和乳桿菌在37℃下培養48 h，而腸球菌、腸桿菌和產氣莢膜菌37℃下培養24 h。每個稀釋度和每種培養基分別設置三個重復。培養結束后進行菌落平板計數，計算每克糞便中各菌落菌數并取對數即lg（CFU·g-1），進行統計分析[10]。以糞便中雙歧桿菌與腸桿菌的菌數比值（B/E）作為評價小鼠腸道微生物定植能力的指標。

1.5 糞便中短鏈脂肪酸的測定

參考WANG G 等[11]的方法對糞便中的SCFAs 進行提取和測定。取上述糞樣均質液2mL 在10000r·min-1下離心10 min，吸取1 mL 上清液，加入100 μL的10%硫酸溶液（v/v）酸化，而后加入2 mL 乙醚萃取脂肪酸，靜置30 min 后吸取上層乙醚相，加入0.5 g無水硫酸鈉進行干燥，靜置30 min 后，10 000 r·min-1離心10 min，取上層乙醚相待測分析。

利用氣相色譜法檢測上述乙醚相中乙酸、丙酸和丁酸的含量，色譜柱為Agilent DB-WAX 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm）。檢測過程的升溫程序：以10℃·min-1升溫速率從80℃加熱至110℃，保持1 min，而后以5℃·min-1升溫速率升至140℃，保持3 min。采用N2、H2和空氣的混合氣體作為載氣，三種氣體的流速分別為25、40 和400 mL·min-1，柱壓為15.5 kPa，分流比為30∶1。

1.6 免疫功能測定

實驗結束后，從低聚木糖受試組和空白對照組中，各挑取小鼠6 只靜脈采血，靜置30 min 后離心制得血清，利用南京建成的ELISA 試劑盒測定血清中的免疫相關蛋白（IgG、IgA 和IgM）的含量。

1.7 統計方法

試驗數據采用SPSS 21.0 的單因素方差分析（one-way ANOVA）進行分析。采用t 檢驗比較組間差異顯著性，結果以（±s）來表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同品質的低聚木糖對乳桿菌和雙歧桿菌生長的影響

本研究通過體外培養考察了不同低聚木糖對乳桿菌和雙歧桿菌生長的影響。從圖1 可知，RXOS和HXOS 均對植物乳桿菌和德氏乳桿菌的生長具有促進作用。此外，添加0.5% HXOS 對兩種乳桿菌的增殖作用還略高于添加1% RXOS，說明HXOS比RXOS 對乳桿菌的增殖作用更強。兩種低聚木糖對雙歧桿菌的增殖作用呈現了相同的趨勢，在不同的添加量情況下，HXOS 對雙歧桿菌的增殖作用均顯著高于RXOS。上述結果表明，木二糖和木三糖的含量越高，對益生菌的增殖作用越強。

圖1 兩種低聚木糖對乳桿菌（A）和雙歧桿菌（B）生長的影響

2.2 不同低聚木糖對小鼠腸道菌群的影響

本實驗考察了兩種低聚木糖連續灌胃14 d 對小鼠腸道內3 種微生物生長的影響。從表1 可知，空白對照組小鼠腸道內的腸桿菌和產氣莢膜菌數量在實驗前后未發生顯著變化，但腸球菌的數量與實驗前相比顯著增加（P ＜0.05）。在連續給予RXOS 14 d后，腸球菌的生長無顯著變化，而攝入HXOS 14 d后，同樣抑制了腸球菌的生長。不同的低聚木糖對小鼠腸道內腸桿菌的生長呈現了相似的影響趨勢，在灌胃兩種高劑量的低聚木糖14 d 后，與灌胃前相比，腸桿菌數量顯著降低（P<0.05）。兩種低聚木糖均顯著抑制了小鼠腸道內產氣莢膜菌的生長，灌胃兩種低劑量低聚木糖14 d 后，產氣莢膜菌的數量顯著低于正常對照組（P<0.05），此外研究發現在灌胃高劑量時，HXOS 比RXOS 對產氣莢膜菌抑制作用更強（P<0.05）。結果表明，低聚木糖能顯著抑制腸道中有害菌的生長，并且高劑量木二糖和木三糖對有害菌具有更強的抑制作用。

表1 不同低聚木糖對小鼠腸道菌群的影響[n=12，lg（CFU·g-1）]

通過考察兩種低聚木糖對雙歧桿菌和乳桿菌生長的影響研究（表1），攝入高劑量的RXOS 14 d后，與空白對照組相比，乳桿菌數量增長了10.5%，與灌胃前相比增長了9.8%。而攝入HXOS 14 d 后，與空白對照組相比，低劑量組和高劑量組中乳桿菌數量分別增長了12%和16.7%，與灌胃前相比分別增加了13.1%和19.5%。同樣，兩種低聚木糖對雙歧桿菌也呈現了顯著的增殖作用（P<0.05），其中攝入高劑量的HXOS 14 d 后，與空白對照組、灌胃前和RXOS 高劑量組相比，雙歧桿菌的數量分別增加了23%、21%和12.4%。結果表明，低聚木糖能顯著增加腸道內有益微生物的生長，并且木二糖和木三糖對有益菌具有更強的增殖作用。

B/E ≥1 表示腸道定植抗力正常，B/E<1 表示腸道定植抗力降低[2]。由表2 可知，灌胃RXOS 14 d后，高劑量組的B/E 值顯著增加，在灌胃HXOS 14 d后，低劑量組和高劑量的B/E 值均顯著增加，而且高劑量的B/E 值比灌胃普通低聚木糖的高劑量組提高了17.8%。結果表明，低聚木糖具有能夠改善腸道菌群結構的功能，而且木二糖和木三糖具有更強的作用效果。

表2 2 種低聚木糖對小鼠腸道菌群B/E 值的影響

2.3 低聚木糖對小鼠腸道內SCFAs 的影響

SCFAs 作為腸道菌群主要的代謝產物之一，對維護宿主的腸道健康具有重要作用[2]。本研究檢測了不同的低聚木糖灌胃14 d 后，小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量（表3），灌胃兩種低聚木糖14 d后，不同劑量組中乙酸含量均顯著增加（P<0.05），說明攝入低聚木糖能夠有效促進小鼠腸道內的微生物代謝產生乙酸，且HXOS 組比RXOS 組具有更高的乙酸含量。丙酸在小鼠腸道內的含量顯著低于乙酸和丁酸，灌胃兩種低聚木糖14 d 后，RXOS 高劑量組以及HXOS 低劑量組和高劑量組中丙酸的含量增加，差異具有統計學意義，此外HXOS 高劑量組的丙酸含量比RXOS 高劑量組提高了50%。丁酸在維持腸道內環境穩定和預防結腸癌等方面具有優良的作用[12]，灌胃14 d 后在不同組別中，丁酸含量均有所增加，其中RXOS 的高劑量組以及HXOS低劑量組和高劑量組的丁酸含量增加顯著，具有統計學意義（P<0.05），而且HXOS 高劑量組的丁酸含量比RXOS 高劑量組提高了36.4%（P<0.05）。上述結果表明木二糖和木三糖相比于其他低聚木糖組分，能更促進SCFAs 的產生。

表3 2 種低聚木糖對小鼠糞便中SCFAs 含量的影響（n=12，mg·g-1）

2.4 兩種低聚木糖對小鼠血清免疫球蛋白含量的影響

免疫球蛋白是由漿細胞合成分泌的一組具有抗體活性的蛋白質，主要包括IgG、IgA 和IgM 等五種類型，在體液免疫中發揮重要作用[13]。兩種低聚木糖對小鼠血清中免疫球蛋白含量的影響見表4?？瞻讓φ战M的小鼠灌胃前后免疫球蛋白數量未發生顯著變化。與空白對照組相比，IgG 和IgM 含量顯著增加（P<0.05），并且比灌胃前分別提高了31.8%和57.5%。然而RXOS 低劑量組的三種免疫球蛋白含量均無顯著增加。灌胃HXOS 14 d 后，與空白對照組和灌胃前相比，IgA 的含量未顯著變化，但低劑量組和高劑量組的IgG 和IgM 含量均顯著增加（P<0.05），并且高劑量組的免疫球蛋白含量高于RXOS的高劑量組，其中IgM 含量的增加了17.5%，表明低聚木糖中木二糖和木三糖含量的增加，提高了小鼠免疫球蛋白的含量，增強了小鼠的體液免疫功能。

表4 2 種低聚木糖對小鼠血清免疫球蛋白含量的影響（n=12，μg·mL-1）

3 討論

本研究首先通過體外培養發現，與RXOS 相比，HXOS 對雙歧桿菌和乳桿菌具有更明顯的促進作用，這與RAJAGOPALAN G 等[14]的研究一致。小鼠體內研究同樣表明，HXOS 更顯著地增加了小鼠腸道內雙歧桿菌和乳桿菌的含量，對腸球菌、腸桿菌和產氣莢膜菌等有害菌的生長抑制作用更強。并且與RXOS 相比，這種低聚木糖更加促進了小鼠腸道代謝產生乙酸、丙酸和丁酸，提高了腸道內SCFAs的總量。李婉等[12]使用BALB/C 小鼠，連續給予低聚木糖14 d 后，發現糞便中雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌數量顯著增加，有害菌數量顯著降低，并且低聚木糖促進了小鼠腸道代謝產生SCFAs。

在給予小鼠灌胃HXOS 14 d 后，血清中IgM 和IgG 的水平顯著提高，且比灌胃RXOS 具有更高的促進作用，說明木二糖、木三糖比其他低聚木糖組分對人體的體液免疫具有更好的保護作用。孫攀峰等[15]發現，在斷奶仔豬飼料中添加低聚木糖，提高了仔豬血清中IgG 和IgM 的含量，但對IgA 含量沒有顯著影響，這與本研究結果一致。方桂友等[16]同樣發現，添加低聚木糖的仔豬血清IgG 和IgM 含量顯著高于空白對照組和抗生素組。陳小連等[4]考察了楊樹多酚和低聚木糖對斷奶仔豬生長、免疫和抗氧化能力的影響，結果發現在仔豬飼料中添加低聚木糖后，血清中IgA、IgM 和IgG 含量均顯著增加。

本研究表明木二糖/木三糖在促進雙歧桿菌和乳桿菌等有益菌增殖，抑制有害菌生長，提高機體免疫力等方面比其他低聚木糖組分具有更高的生物活性，因此要推動低聚木糖在食品、保健品上的應用，應盡可能提高產品中木二糖和木三糖的含量以提升低聚木糖產品的品質。