交聯劑結構對可生物降解殼聚糖水凝膠性能影響的研究

王帥,黃燦鋒,朱東雨,姜濤,陳至鵬

(1.廣東工業大學 輕工化工學院,廣東 廣州 510006;2.化學與精細化工廣東省實驗室揭陽分中心,廣東 揭陽 515200;3.廣東順德創新設計研究院,廣東 佛山 528311)

羧甲基殼聚糖(CMCS)作為殼聚糖的衍生物具有豐富的氨基和羧基,其水凝膠被廣泛應用在生物材料中,例如載藥凝膠[1]、傷口敷料[2]、組織工程等[3]。但目前的CMCS水凝膠交聯劑中往往存在離子脫落[4]、反應效率低[5]和細胞毒性等[6]問題,限制了其應用。醛基多糖不僅能賦予水凝膠雙醛官能團,還具有良好的生物安全性,吸引了人們的廣泛關注[7-9]。但是多糖來源廣泛,不同醛基多糖交聯的CMCS水凝膠性能相差較大,為了更有針對性地選擇多糖進行醛基化改性,本文在相同反應條件下制備了8種不同結構的醛基多糖,然后分別制備了CMCS/醛基多糖水凝膠,并對其生物、物理化學性能進行評估。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

羧甲基殼聚糖(CMCS,取代度≥90%);海藻酸鈉[SA,粘度(200±20) mPa·s,純度99.9%];環糊精(CD,純度98%);羥乙基淀粉(HES,取代度≥50%,純度98%);羥乙基纖維素(HEC,粘度1 500～2 500 mPa·s);羧甲基纖維素(CMC,純度99%);普魯蘭多糖(Pul,粘度15～180 mPa·s);葡聚糖(Dex,Mw=4×104);硫酸軟骨素(CS,純度90%);高碘酸鈉(NaIO4)、乙二醇、無水氯化鈣(CaCl2,純度99.9%)、鹽酸羥胺、氫氧化鈉(NaOH)、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純;MTT(純度97%);MEM培養基;L929小鼠成纖維細胞;去離子水(H2O)。

美國THEMOR-FILSHER iS50R全波段研究級紅外光譜儀;捷克泰思肯TESCAN MIRA4型掃描電鏡;奧地利安東帕MCR301旋轉流變儀。

1.2 醛基多糖交聯劑的制備

以CD為例,取2.138 9 g NaIO4溶于30 mL純水中,攪拌溶解,按摩爾比1∶1往NaIO4溶液里加入一定質量CD,避光攪拌反應8 h,加入200 μL乙二醇繼續避光攪拌2 h以終止反應,并置于透析袋中透析3 d,最后凍干得到白色固體產物醛基環糊精(OCD)。SA、HES、HEC、CMC、Pul、Dex、CS 7種多糖均采用以上方式在同一條件下氧化制備得到對應的醛基多糖氧化物OSA、OHES、OHEC、OCMC、OPul、ODex、OCS。

1.3 殼聚糖水凝膠的制備

以CMCS/OCD水凝膠為例,取4 mL 6%(m/v)的CMCS溶液于玻璃瓶中,加入700 μL 5%(m/v)的OCD溶液,快速攪拌均勻后置于45 ℃烘箱中交聯反應4 h,得到CMCS/OCD水凝膠。CMCS/OSA、CMCS/OHES、CMCS/OHEC、CMCS/OCMC、CMCS/OPul、CMCS/ODex、CMCS/OCS七種水凝膠均采用以上方式制備。

1.4 紅外光譜分析

采用全波段研究級紅外光譜儀來分析醛基多糖交聯劑和多糖水凝膠的結構,分辨率1 cm-1。對于不同結構的醛基多糖,將凍干后的樣品研磨成粉,采用溴化鉀壓片法進行測試;對于水凝膠,將樣品凍干后,直接采用ATR法測試。

1.5 醛基取代度的測試

采用鹽酸羥胺-NaOH滴定法測定醛基多糖的醛基取代度[10],具體方案如下:①配制0.25 mol/L的鹽酸羥胺-甲基橙溶液:取4.375 g鹽酸羥胺溶于40 mL純水中,加入1.5 mL甲基橙溶液(0.05%),將溶液稀釋定容在250 mL。②醛基濃度測定:取0.1 g樣品醛基多糖,溶解于25 mL鹽酸羥胺-甲基橙溶液中,靜置2 h后,用0.1 mol/L的標準NaOH溶液滴定,滴定終點為溶液顏色由紅色變為黃色,并記錄加入的NaOH的體積和對應的pH。以VNaOH為橫坐標,pH為縱坐標繪制曲線并對曲線進行一階微分,微分曲線的峰值對應的橫坐標即為滴定終點所消耗的VNaOH。③取代度計算:醛基取代度計算依據公式(1)。

(1)

式中,DSCHO為醛基取代度,mol/mol;VNaOH為消耗的NaOH的體積,mL;c標為標準NaOH的濃度,mol/L;M多糖為多糖的摩爾質量,g/mol;m樣為樣品質量,g。

1.6 掃描電鏡

將CMCS/醛基多糖水凝膠凍干后噴金,并固定在樣品臺上,使用掃描電鏡觀察多糖水凝膠的形貌結構。

1.7 溶脹性能測試

將CMCS/醛基多糖水凝膠凍干后稱重,并記錄質量為m1,再浸泡在生理鹽水中,每隔30 min取出用濾紙擦干表面水分后稱重,直至水凝膠質量恒定后,記錄此時質量為m2,通過公式(2)計算水凝膠的平衡溶脹率SR。

(2)

式中,m2為平衡溶脹后水凝膠的質量,g;m1為干態水凝膠的質量,g。

1.8 力學性能測試

使用旋轉流變儀探究CMCS/醛基多糖水凝膠的力學性能:將水凝膠樣品裁剪為直徑25 mm,厚度3 mm的小圓片,設定恒定應變γ=1%,溫度T=37 ℃ 進行頻率掃描,頻率范圍ω=1～100 rad/s,并以對數取點測得水凝膠樣品的模量-頻率關系曲線。

1.9 細胞毒性測試

采用MTT法測試CMCS/醛基多糖水凝膠的細胞相容性,具體步驟如下:

①浸提液制備:首先將水凝膠浸泡除去游離組分,凍干滅菌后備用。取無菌處理后的干膠放置于MEM培養基(含10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素溶液)中,溶脹平衡后,置于培養基(2 mg/mL)中37 ℃ 浸提24 h。

②細胞接種和毒性檢測:用胰酶消化對數生長期的L929小鼠成纖維細胞,調節細胞密度為3×104/mL。將細胞懸液接種于96孔細胞培養板中,每孔加200 μL細胞懸液,并在37 ℃、含5%CO2培養箱中培育24 h后,吸棄培養液,實驗組加浸提液,對照組加正常的培養基,每組設立5個平行孔,將培養板置于37 ℃、含5%CO2培養箱中培育24 h,每孔加入MTT液20 μL(5 g/L),常規孵育4 h后吸棄培養液,加入DMSO 150 μL,在37 ℃保溫10 min,振蕩器搖勻40 s,使用酶標儀測490 nm波長處的吸光值A。

L929細胞的細胞活性RGH按如下公式(3)計算:

(3)

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

以CD為例,所制備的醛基多糖及其水凝膠的紅外光譜見圖1。

圖1 CD,OCD,CMCS和CMCS/OCD水凝膠的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra:CD,OCD,CMCS and CMCS/OCD hydrogel

由圖1可知,3 200～3 500 cm-1處出現強而寬的吸收峰是CD等多糖結構上—OH的伸縮振動吸收峰,其它7種多糖也在這個位置出現—OH的吸收峰。相比于CD,OCD在1 733 cm-1處出現了醛基的特征吸收峰,表明醛基化改性成功,其它醛基多糖在1 720～1 740 cm-1內也都有明顯的峰,表明剩余7種多糖均發生了氧化反應。當OCD與CMCS復合交聯形成水凝膠(CMCS/OCD)后,1 733 cm-1的特征峰消失,說明—CHO參與了席夫堿反應被消耗掉;同時,CMCS/OCD水凝膠的紅外譜圖在1 669 cm-1處出現了碳氮雙鍵的特征峰,表明生成了亞胺鍵,進一步證明了CMCS的—NH2與OCD的—CHO發生了席夫堿交聯反應。此外,CMCS/OCD水凝膠在3 200～3 500 cm-1處的紅外光譜特征峰向右移,證明CMCS和OCD可能發生了氫鍵相互作用。其余幾種醛基多糖及其多糖水凝膠的紅外譜圖均有類似的規律,表明其余7種多糖水凝膠也均被成功制備。

2.2 醛基取代度

以OCD為例,通過公式(1)計算各種醛基多糖的取代度,8種醛基多糖的醛基取代度匯總見圖2。

圖2 不同氧化多糖的醛基度Fig.2 Oxidation degree of various polyaldehyde polysaccharide

由于分子結構和糖單元的不同,多糖被NaIO4氧化的程度不同,最終導致醛基度的不同。醛基和氨基反應活性高,因此能偶聯多肽、蛋白等生物活性物質,其中OCD和OPul醛基取代度最高,表示其能偶聯的生物活性物質越多,適當的醛基度有利于羧甲基殼聚糖水凝膠在生物學方面的應用。

2.3 不同多糖水凝膠的形貌分析

由圖3可知,在制備的CMCS/醛基多糖水凝膠中,除了CMCS/OCS水凝膠外,其他樣品均顯示出明顯的網狀結構,表面光滑且多孔,孔徑為微米級,說明交聯程度較高。CMCS/OHEC、CMCS/OCMC、CMCS/OCS和其他水凝膠相比孔徑比較大,最高可達400 μm,判斷因為其對應的多糖交聯劑醛基度低,導致水凝膠的交聯度低,孔徑較大,這樣有利于水凝膠溶脹,而其他醛基度較高的多糖水凝膠孔徑就小一些,最高僅為200 μm,這種小而緊密的孔洞有利于提高水凝膠的力學性能。

圖3 復合水凝膠的SEM圖像Fig.3 SEM images of composite hydrogels

2.4 不同多糖水凝膠的溶脹性能

圖4探索了醛基多糖結構交聯CMCS水凝膠在純水里的溶脹性能。多糖凝膠的溶脹比隨著時間的推移先上升直至平緩最終達到溶脹平衡。經過400 min 的浸泡溶脹后,多糖凝膠的質量和體積都有所變化,其中,溶脹比較小的是CMCS/OCD水凝膠、CMCS/OPul水凝膠、CMCS/OHES水凝膠、CMCS/ODex水凝膠、CMCS/OSA水凝膠;具有較大溶脹比的是CMCS/OCS水凝膠、CMCS/OHEC水凝膠,這些多糖凝膠都表現出優秀的吸水和保水能力,并且溶脹比隨醛基含量的增加而降低。主要是因為醛基含量越高,與氨基發生交聯形成交聯點的可能性越大,交聯網絡越密集。因此,在實際應用中,可根據產品的溶脹需求,選擇不同的醛基多糖制備CMCS水凝膠。

圖4 不同水凝膠的溶脹率Fig.4 Swelling ratio of various composite hydrogels

2.5 多糖水凝膠的流變力學性能

通過流變學實驗反映多糖凝膠的力學強度。圖5顯示了不同多糖凝膠的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨應變的變化規律。

圖5 各種復合水凝膠的機械性能Fig.5 Mechanical properties of various composite hydrogels

由圖5可知,在應變范圍內,所有多糖凝膠的G′都大于G″,說明CMCS與醛基多糖均發生交聯形成水凝膠,且具有力學穩定性。從G′來看,CMCS/OCD水凝膠、CMCS/OSA水凝膠、CMCS/OHES水凝膠、CMCS/ODex水凝膠力學強度相對較高,這與這幾種水凝膠的醛基多糖組分有關,醛基度高導致交聯密度增大,進一步使凝膠網絡更牢固,其力學強度越好,具有更好的彈性。

2.6 多糖水凝膠的細胞毒性評價

通過MTT法檢測CMCS/醛基多糖水凝膠的細胞相容性,結果見圖6。

圖6 不同復合水凝膠的細胞活性Fig.6 Cell viability of various composite hydrogels

由圖6可知,L929細胞活性均接近1,證明8種多糖水凝膠均具有良好的細胞相容性。部分多糖水凝膠對L929細胞活性大于1,說明對細胞生長有一定的促進作用,歸因于凝膠主體是生物多糖,在浸提過程中部分凝膠降解,這部分降解產物可作為營養物質促進細胞生長。因此得出結論:CMCS/醛基多糖水凝膠顯示出體外細胞無毒性,并且在一定程度上可以支持細胞生長和增殖,有望應用在生物醫用材料上。

3 結論

本文通過統一氧化反應條件制備了8種醛基多糖,每種醛基多糖僅通過醛基與CMCS的氨基發生席夫堿反應,形成交聯網絡水凝膠。本文還對多糖水凝膠的微觀形貌、溶脹比、流變力學性能和細胞毒性進行對比。醛基滴定結果表明相同條件下多糖的被氧化程度不同,此外不同醛基多糖交聯得到的CMCS水凝膠均顯示無毒,有望應用在生物醫用材料領域。更重要的是,不同醛基多糖交聯的CMCS水凝膠的孔徑、溶脹比和力學強度具有較大的差異,這也對醛基多糖/CMCS水凝膠在實際應用上進行了補充研究,可根據需求,針對不同性能選擇不同的醛基多糖作為殼聚糖水凝膠的交聯劑。