重組膠原蛋白表達體系研究進展

潘家豪，潘煒松，邱健，謝東玲，鄒奇，吳川

（1 中南大學冶金與環境學院，湖南 長沙 410083； 2 湖南諾合新生物科技有限公司，湖南 長沙 410001； 3 中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008； 4 華南師范大學生命科學學院，廣東 廣州 510631）

膠原蛋白是人體細胞外基質的主要蛋白質，在人體中含量豐富，占人體蛋白質三分之一，占皮膚干重四分之三，對于骨骼、皮膚、關節起關鍵的連接作用［1?3］。除了結構上的作用外，膠原蛋白還可以與各種大分子如整合素、裝飾蛋白、纖維連接蛋白、肝素和基質金屬蛋白酶（MMP）發生相互作用，在調節組織再生過程中十分重要［4］。

作為哺乳動物含量最豐富的蛋白質，膠原蛋白為哺乳動物組織提供主要的結構與機械支持，是一種結構特殊、功能多樣的蛋白質，基于其開發的產品已經廣泛應用于生物醫藥、化妝品、皮革、生物科技等行業。比如，空氣干燥澆注形成厚度為0.01～0.015 mm 的膠原蛋白膜可以作為傷口愈合材料和屏蔽膜［5］。膠原蛋白作為一種生物聚合物，還可以與其他親水性聚合物混合形成高質量水凝膠和可生物降解的支架，其中膠原蛋白與殼聚糖共混物的制備已經成為科學界重點關注的課題［6］。膠原蛋白作為皮膚的重要組分，具有維護皮膚外觀和狀況的作用。雖然膠原蛋白本身具有水不溶性，但膠原蛋白水解后產生的小肽與短肽易溶于水，可更好地添加到化妝品中。膠原蛋白成膜特性使其成為一種有效的保濕劑［6?7］，能覆蓋皮膚保持水分，避免表面活性劑損失。目前，膠原蛋白最具有商業價值的用途是作為可溶性蛋白，皮下注射修復損傷性皮膚［8］。此外，通過鞣制等化學過程使生皮中的膠原蛋白交聯，可生產更堅硬、更耐用和防腐蝕的皮革［9］。通過設計與天然細胞外基質環境相似的膠原蛋白支架，能有效揭示細胞行為和相關疾病的發病機制［10?13］。

現階段膠原蛋白大體分為動物源膠原蛋白和重組膠原蛋白。動物源膠原蛋白雖然是膠原蛋白主要來源，但大多來源于陸生動物與海洋動物，陸生動物膠原蛋白已交聯嵌入到原生組織上，對提取與純化技術要求比較嚴苛［14］。此外，病原體污染以及過敏性風險也成為陸生動物膠原蛋白不可回避的問題［15?16］。海洋膠原蛋白能有效避免陸生動物膠原蛋白病原體污染以及過敏性風險的問題，但具有提取難和純化成本較高等劣勢［17］。重組膠原蛋白是將人膠原蛋白基因克隆到選定的表達載體并轉化到表達細胞內，最后通過純化技術所獲得的蛋白質。由于重組膠原蛋白分子單一、結構清晰、易于控制，已成為生物醫學以及組織工程代替動物源膠原蛋白的最佳替代物［18］。此外，重組膠原蛋白技術還可用于其他動物（鳥類和海洋物種等）特異性膠原蛋白的生產。

根據2021 年3 月15 日國家藥監局對外發布的《重組膠原蛋白生物材料命名指導原則》［19］，可將重組膠原蛋白分為3 類：①重組人膠原蛋白，由DNA 重組技術制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長氨基酸序列，為三螺旋結構；②重組人源膠原蛋白，由DNA 重組技術制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合；③重組類膠原蛋白，由DNA 重組技術制備的經設計、修飾后的特定基因編碼的氨基酸序列或其片段，或是這類功能性氨基酸序列片段的組合，這種基因編碼序列或氨基酸序列與人膠原蛋白的基因編碼序列或氨基酸序列同源性低。本文首先對膠原蛋白的結構、分布、形成過程進行闡述，再對重組膠原蛋白表達體系以及應用領域進行詳細說明，最后對膠原蛋白前景進行展望。

1 膠原蛋白

1.1 膠原蛋白結構

膠原蛋白是含有三螺旋結構（圖1）的纖維狀膠原蛋白，約占蛋白總質量的三分之一，其中哺乳動物中膠原蛋白含量最高的是肌腱（80%），其次是皮膚（70%）、骨骼（25%）以及主動脈（20%）［21?22］。膠原蛋白的基本組成單位是由3 條α鏈組成的原膠原。正是由于原膠原分子中3個平行α 鏈以一個接一個殘基交錯形成的聚脯氨酸Ⅱ型（PPⅡ）左手螺旋構象決定了膠原蛋白結構［23］。擁有正確折疊的三螺旋結構對于膠原蛋白在細胞外基質實現細胞與細胞之間相互作用至關重要［24］。在三螺旋結構中每一個α 鏈都由重復肽三聯體（Gly?Xaa?Yaa）組成，其中Xaa 和Yaa 通常是脯氨酸和羥脯氨酸［25］。由于高度螺旋化，三聯體中的3 個氨基酸殘基在螺旋內部占據不同的位置。其中，甘氨酸殘基埋藏在中心，溶劑不容易進入；Xaa 位置的氨基酸殘基高度暴露于溶劑中；Yaa 位置由于靠近相鄰鏈，因此被溶劑接觸的可能性較低［26］。對Gly?Xaa?Yaa的大量研究揭示了影響膠原蛋白三螺旋結構穩定的多重因素［27］，這些因素包括3條鏈條的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水合網絡以及高含量的脯氨酸和羥脯氨酸形成。由于三螺旋結構在225 nm 與198 nm 附近具有典型的圓二色光譜，通過觀察膠原蛋白圓二色光譜在225 nm 處平均殘余橢圓率隨溫度升高的變化，可以測定其熱穩定性，求出的熔融溫度是決定三螺旋結構穩定性的關鍵指標［28］。

圖1 膠原蛋白結構［20］（膠原蛋白一級結構展示了膠原蛋白主要由脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等氨基酸構成；二級結構則展示了脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等氨基酸通過α螺旋使膠原蛋白二級結構趨于穩定；三級結構展示了3條α鏈經過左手螺旋構象形成原膠原）Fig. 1 Structure of collagen[20](The primary structure of collagen shows that collagen is mainly composed of amino acids such as proline, glycine and hydroxyproline. The secondary structure shows that amino acids such as proline, glycine and hydroxyproline stabilize the secondary structure of collagen through α?helix. The tertiary structure shows that three α?chains passing through the left?hand helical conformation form procollagen.)

1.2 膠原蛋白類別

膠原蛋白作為最豐富的動物蛋白，至今已發現28 種類型［23，29?30］（表1），而根據膠原蛋白所形成具有不同活性的形態結構可將膠原蛋白類型大致分為纖維性膠原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅪ、ⅩⅩⅦ型）與非纖維性膠原蛋白（Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅢ、ⅩⅣ、ⅩⅤ、ⅩⅥ、ⅩⅦ、ⅩⅧ、ⅩⅨ、ⅩⅩ、ⅩⅪ、ⅩⅫ、ⅩⅩⅢ、ⅩⅩⅣ、ⅩⅩⅤ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ、ⅩⅩⅧ型）。其中非纖維性膠原蛋白可分為網狀膠原蛋白、珠狀絲狀膠原蛋白、錨定纖維蛋白、膜蛋白以及multiplexins 膠原蛋白［30?32］。纖維性膠原蛋白中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白占人體膠原蛋白的80%～90%［15，29］。Ⅰ型膠原蛋白作為人體中最常見的膠原蛋白，主要分布在皮膚、肌腱和骨骼中，Ⅱ型主要分布在軟骨中，Ⅲ型主要分布在皮膚和血管系統中［33］。同時，纖維性膠原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等）中Gly?Xaa?Yaa 結構不間斷重復形成穩定而又緊密的結構，而所有非纖維型膠原蛋白如Ⅳ型、Ⅶ型和Ⅸ型中Gly?Xaa?Yaa均含有一個或多個中斷［34］，在這些中斷的序列中常常形成靈活的鏈條，使非纖維性膠原蛋白完成特定功能［30］。雖然驅動膠原蛋白空間的組織機制可能涉及細胞結構與組織機械架構，但膠原蛋白鏈的氨基酸序列存儲了膠原蛋白組裝成原纖維和網絡的基本信息［35?38］。

表1 膠原蛋白類型、分布及功能［23，29?30］Table 1 Collagen type, distribution and function[23,29?30]

部分膠原蛋白三螺旋結構是由3條相同的α鏈組成，稱為同源三聚體型，如Ⅱ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白均屬于同源三聚體型。而動物含量最豐富的Ⅰ型膠原蛋白是由兩條不同的α鏈形成異源三聚體（α1［Ⅰ］2α2［Ⅰ］）。膠原蛋白的合成總是伴隨著與三螺旋結構密切聯系的非膠原蛋白結構域，這可能對于膠原蛋白三聚體化、鏈配位或生物相互作用具有重要作用［39］。膠原蛋白合成過程中，這些非膠原蛋白結構域一部分沉積保留在細胞外基質中，另一部分則可能被水解切割并表達功能［40］。

1.3 膠原蛋白生物合成機制

膠原蛋白的形成始于膠原蛋白編碼基因通過轉錄、翻譯等作用形成新生膠原蛋白α鏈（稱為前α 鏈）（圖2）［26，41］，膠原蛋白前α 鏈在內質網中先后經歷脯氨酸?4?羥化酶（P4H）與賴氨酸羥化酶（LH）的修飾作用，使Gly?Xaa?Yaa 中Yaa 位上的脯氨酸殘基與賴氨酸殘基分別羥基化，而一部分羥基化賴氨酸殘基則進一步糖基化［1，41］。脯氨酸羥基化和賴氨酸羥基化分別是實現三螺旋結構的穩定性和細胞外成熟膠原交聯的必需步驟。若新生膠原蛋白 α 鏈羥基化出現畸形，形成的不良膠原蛋白三螺旋結構將在細胞內堆積，導致蛋白質折疊和內質網應激反應［42?45］。除了P4H 與LH 作用外，前膠原蛋白α 鏈還需要脯氨酸?3?羥化酶（P3H）進行修飾。隨后，3 條膠原蛋白前α 鏈的C端前肽在內質網膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯蛋白和內質網氧化還原酶PDI的協同作用下形成的二硫鍵［46?49］，并將膠原蛋白α 單鏈三聚體化，形成三螺旋構象，這種構象從C 端一直持續到N 端［43］。同時，膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47 與三螺旋前膠原蛋白相互作用，防止前膠原蛋白局部展開和聚集［26］。經膠原蛋白特異性分子伴侶HSP47 作用后，前膠原蛋白被內質網出口TANGO1 識別，運輸到高爾基體中。在高爾基體中，HSP47 從前膠原蛋白解離，并通過KDEL（REDL）受體返回內質網中。同時，高爾基體將前膠原蛋白運送分泌到細胞外基質，通過N端酶與C端酶的共同作用將前膠原蛋白多余N端與C端前肽進行切除，形成完整的膠原蛋白分子［50］。

圖2 膠原蛋白合成機制圖［26，41］P-脯氨酸殘基；K-賴氨酸殘基；P4H-脯氨酰4?羥化酶；LH-賴氨酰羥化酶；P3H1-脯氨酰3?羥化酶；HSP47-熱休克蛋白47；PDI-二硫異構酶；FKPB65-免疫親蛋白；PNP-原膠原N端酶；PCP-原膠原C端酶（首先膠原蛋白 α 鏈經內質網中P4H 酶以及LH 酶的作用下實現羥基化，隨后，3 條膠原蛋白α 單鏈的C 端前肽在內質網膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯蛋白和內質網氧化還原酶PDI的協同作用下形成二硫鍵。HSP47能有效防止前膠原蛋白局部展開和聚集形成。最后，前膠原蛋白經高爾基體運送至細胞質基質利用N端酶與C端酶將多余N端與C端進行切除，形成完整的膠原蛋白結構）Fig. 2 Mechanism of collagen synthesis[26,41]P-proline residue; K-lysine residue; P4H-prolyl 4?hydroxylase; LH-lysyl hydroxylase; P3H1-prolyl 3?hydroxylase; HSP47-heat shock protein 47; PDI-disulfide isomerase; FKPB65-immunophilic proteins; PNP-procollagen N protease; PCP-procollagen C protease(Firstly, collagen genes form collagen α?chains through transcription and translation, and secondly, under the action of P4H enzymes and LH enzymes in the endoplasmic reticulum, collagen α?chain is hydroxylated. Subsequently, three collagen α single?stranded C?terminal propeptides form disulfide bonds under the synergistic action of endoplasmic reticulum lectin?like chaperones, calcepiprotein, and endoplasmic reticulum oxidoreductase PDI. HSP47 effectively prevents the formation of local expansion and aggregation of pre?collagen. Finally, the cytoplasmic matrix of the procollagen is transported by the Golgi apparatus and the excess N?terminal and C?terminus of the precollagen are excised by N?terminal enzymes and C?terminal enzymes to form a complete collagen structure.)

2 重組膠原蛋白表達體系

隨著分子生物技術的迅猛發展，蛋白表達技術越來越成熟與規范，科學研究者逐漸將重心從研究動物源性膠原蛋白轉移到重組膠原蛋白表達上［51?52］。重組膠原蛋白的表達體系主要包括原核生物（主要為大腸桿菌）、酵母、植物、桿狀病毒、哺乳動物細胞表達體系［53?57］?，F階段表達體系中以大腸桿菌、酵母為主，但高效的大腸桿菌、酵母等表達體系缺乏動物細胞中膠原蛋白翻譯后修飾，需要添加相對應的重組酶。而植物、桿狀病毒、哺乳動物細胞表達體系所產生膠原蛋白含量雖然遠低于大腸桿菌、酵母體系，但具有完整的三螺旋結構和較好的熱穩定性（表2）。

表2 不同表達體系產生膠原蛋白含量及種類Table 2 Content and types of collagen produced by different expression systems

不同重組膠原蛋白表達體系表達膠原蛋白所需成本仍有比較大的區別（表3），植物表達體系因其具備光合作用自生產能力，其表達膠原蛋白成本相對較低；大腸桿菌以及酵母雖然具備一定發酵成本，但由于其表達產量較高，表達單位膠原蛋白所需成本也較低，但表達的膠原蛋白缺乏羥基化及相應活性；昆蟲桿狀病毒表達體系由于其表達量少，生產周期長，因此其表達單位膠原蛋白成本較高；哺乳動物細胞表達體系屬于高級重組表達體系，由于其表達體系復雜，培養要求高，因此其表達單位膠原蛋白的成本也較高。

表3 不同表達體系生產膠原蛋白成本及優缺點Table 3 Costs, advantages and disadvantages of collagen production in different expression systems

2.1 大腸桿菌表達體系

大腸桿菌表達體系由于其遺傳背景清晰、發酵成本較低、生產周期短、效率高等優點，已被用來大規模制造外源蛋白，但大腸桿菌表達體系同樣具有產生膠原蛋白缺乏羥基化過程的缺點。大腸桿菌表達體系具備細菌膠原蛋白的出現為利用大腸桿菌生產重組膠原蛋白提供了新的機遇。常見的載體主要包括pGE、pET 系列［79］。雖然大腸桿菌在表達重組膠原蛋白過程中通常缺少羥基化過程，但仍然能產生較為穩定的三螺旋膠原蛋白結構［80］。

起初，Yin等［58］研究了52個重復肽（GAPGAP GSQGAPGLQ）組成的膠原蛋白樣聚合物CLP3.1?his在大腸桿菌表達情況，同時比較了不同啟動子（熱誘導啟動子、T7 啟動子和T7lac 啟動子）和不同抑制強度基礎轉錄的大腸桿菌菌株（BL21、BL21（DE3）和BL21（DE3）［pLysS］）對聚合物CLP3.1?his 產量的影響，結果表明，含T7 啟動子的BL21（DE3）［pLysS］菌株與含T7lac 啟動子的BL21（DE3）菌株產生的CLP3.1?his 含量大于細胞總蛋白的40%，表達量在100～200 mg/L。這項研究為后續重組膠原蛋白的大腸桿菌表達體系提供了寶貴的理論與實踐基礎，發現的這兩種菌株有望用于大規模的重組膠原蛋白生產。隨后，常海燕［59］通過將人源性Ⅱ型膠原蛋白cDNA 重組到大腸桿菌內，考察發酵因素對分批?補料培養生產類人源性Ⅱ型膠原蛋白的影響，研究發現當培養溫度為34 ℃、pH 為6.5、溶氧濃度為20%、比生長速率為0.20～0.25 h-1以及誘導時間控制在細胞對數生長中后期時，大腸桿菌發酵產生類人膠原蛋白Ⅱ型含量最多，細胞密度最大，最高可產生13.2 g/L 類膠原蛋白Ⅱ型，重組類人膠原蛋Ⅱ型實現了產業化，為醫藥領域提供了更優質膠原蛋白產品。近幾年來，重組膠原蛋白已經逐步應用到化妝品行業，公眾對重組膠原蛋白生物安全性要求越來越高。楊晶等［60］構建了重組類人Ⅰ型膠原蛋白基因的原核表達載體pET28a?rhC，將其轉入大腸桿菌BL21（DE3）進行誘導表達，獲得分子量約為40 kDa、表達量為520 mg/L 的重組蛋白。DPPH 與MTT 試驗表明該重組膠原蛋白具有一定抗氧化性，能有效促進小鼠纖維細胞3T3細胞的增殖。該重組蛋白雖然不具備完整的三螺旋結構，但可作為護膚品添加劑應用于化妝品行業，也可作為促進傷口愈合止血材料應用于醫療行業。

由于大腸桿菌表達體系缺乏使膠原蛋白三螺旋結構穩定的羥基化酶，因此膠原蛋白在大腸桿菌大規?；a遇到了挑戰［41］。此外，未羥基化膠原蛋白相較于天然羥基化膠原蛋白的Tm值低10 ℃，對于使用大腸桿菌等表達體系高效表達存在重大障礙［40］。這種挑戰可以通過添加P4H 基因以及相應膠原蛋白基因來解決。Rutschman 等［61］利用人Ⅲ型部分膠原蛋白編碼基因（COL3A1）與病毒源的賴氨酰羥化酶L230 基因和脯氨酸羥化酶L593 基因在大腸桿菌中共表達，獲得了與人體膠原蛋白羥基化相似的膠原蛋白，該膠原蛋白具有一定的三螺旋結構和較好的熱穩定性。同時，Liu等［62］利用炭疽桿菌P4H 基因與大腸桿菌中的膠原蛋白基因共表達，并對其在5L 發酵罐中進行分批補料發酵，獲得了產量為0.8 g/L 的羥基化膠原蛋白，并提高了重組膠原蛋白的生物相容性，為生物材料工程應用提供了一種富有前景的材料。

2.2 酵母表達體系

酵母作為真核生物，可對分泌重組蛋白進行修飾。與動物表達體系不同的是，酵母產生重組蛋白不含病原體、病毒包涵體或者熱源，具有較高的安全性，發酵成本較低。同時以酵母為基礎的生產工藝能滿足重組蛋白質高效批量生產的要求，產量多在克/升BMM 培養基范圍之內［64，81］。但是利用酵母表達體系產生膠原蛋白大多為同源性膠原蛋白，生產異源性膠原蛋白較為困難。至今為止，研究者已開發了多種酵母為宿主的表達體系，如畢赤酵母、漢遜酵母以及啤酒酵母等［10］，其中畢赤酵母作為應用最廣泛的酵母種類，與其他酵母相比，所翻譯加工的重組膠原蛋白具有二硫鍵、糖基化、蛋白水解過程等優勢特征［82?84］。

起初，Vuorela等［63］研究了膠原蛋白脯氨酸?4?羥化酶在畢赤酵母表達載體PAO815 與PARG815中的表達，通過將膠原蛋白多肽鏈引入表達載體與脯氨酸?4?羥化酶共表達，結果發現脯氨酸?4?羥化酶表達量增加，生產的羥基化Ⅲ型膠原蛋白含量高達2.15 g/kg，這表明穩定的脯氨?；??羥化酶的產生需要膠原蛋白的表達，而穩定的膠原蛋白的組裝也需要酶的表達，研究結果為畢赤酵母高產量表達提供了新的路徑。高力虎［64］從工藝優化的角度出發，通過甲醇誘導畢赤酵母菌株GS115高效表達了分子量為112 kDa 的重組類人膠原蛋白Ⅲ型，發現了最佳誘導酵母菌株GS115 表達的條件，即甲醇添加量為1.5%、初始菌濃度為3.0 OD6oo/mL、收獲時間為60 h、初始pH 為6.6 時，所獲得重組類人膠原蛋白Ⅲ型表達量可達60.1 mg/L。雖然重組類人膠原蛋白Ⅲ型不具備三螺旋結構，活性較差，但該工藝為實現酵母工程發酵法制備類膠原蛋白作了有益的探索。隨后幾年，Wang 等［65］利用釀酒酵母α?交配因子prepro信號分泌表達了重組人全長成熟膠原蛋白α1［Ⅲ］（rhCOL3A1）鏈，其理論分子量可達95.344 kDa，發現當混合碳在0.8（甘油/甲醇）比例下，誘導rhCOL3A1 達到最高產率（1.27 g/L）的時間可大幅縮短50%。該研究建立了一種有效的混合發酵策略，為大規模生產全長成熟rhCOL3A1 提供一種省時有效的新策略。到2017年，西北大學范代娣團隊［66］通過對畢赤酵母生長階段的BMGY 培養基進行優化，發現當酵母提取物為1.13%、蛋白胨為1.61%、甘油為0.86%比例時，在BMGY 培養基條件下培養12 h，生長階段中畢赤酵母的菌重量增加26%，所得重組類Ⅲ型膠原蛋白含量增至4.7 g/L，該膠原蛋白對因乙酸灼傷的大鼠胃黏膜有較好的修復作用。

雖然酵母工程菌能實現重組膠原蛋白羥基化的過程，但產生的重組膠原蛋白多為同源三聚體（Ⅱ、Ⅲ型），對于異源三聚體（如Ⅰ型）的生產較為困難。而Ⅰ型膠原蛋白作為身體中分布最廣的膠原蛋白，其生產具有重要意義。因此，實現異源型膠原蛋白在酵母工程菌中的表達成為一項重要技術。2019 年，侯增淼等［67］成功利用人Ⅰ型膠原蛋白Gly?Xaa?Yaa 序列搭建了pPIC9K?COL 表達載體，并通過畢赤酵母工程菌發酵，最終獲得純度大于95%、表達量高達4.5 g/L 的重組人Ⅰ型膠原蛋白，掃描電鏡和小鼠成纖維細胞毒性試驗表明確定，該蛋白具有良好的多孔纖維結構與細胞相容性。同時，該重組人Ⅰ型膠原蛋白的高發酵產量表達說明酵母工程菌具備生產異源三聚體的條件，這為實現重組人Ⅰ型膠原蛋白工業化以及膠原蛋白生物醫藥材料產業化提供了可能。

2.3 植物表達體系

植物表達體系已經成為分子醫藥的核心部分，由于所生產的抗體、疫苗可規?；?、生產周期短、成本低、安全性高的優點，植物表達體系越來越受到大眾的喜愛［85］。植物表達體系在蛋白提取和純化技術及工藝的持續進步，下游加工成本大幅度降低的背景下，所產生的蛋白質含量與微生物和動物表達體系所產生的蛋白相比不再呈現數量級的差異［83］。但是，利用植物表達體系生產膠原蛋白與其他體系相比，仍具有產量較低、產能不足的缺點。

起初，Ruggiero 等［68］在2000 年利用煙草植物作為一種新的表達方式生產人類同型三聚體Ⅰ型膠原蛋白，通過將編碼人Ⅰ型膠原蛋白proα1［Ⅰ］鏈連接到二元質粒pBIOC21，使煙草中重組人Ⅰ型膠原蛋白鏈以二硫鍵合的形式表達，表達量最高可達100 mg/kg 鮮葉，并具有穩定的同型三聚體三螺旋結構。該研究雖然沒有實現膠原蛋白羥基化，但為實現重組膠原蛋白在煙草中的表達提供了可能性，也為該團隊后續研究提供了豐富的經驗與理論基礎。隨后兩年，團隊人員Merle 等［69］在此基礎上，改進了煙草表達系統，利用瞬時表達技術成功將煙草植物與人Ⅰ型膠原蛋白和P4H 酶共同轉化，成功生產了重組羥基化同型三聚體膠原蛋白，表達量穩定在50～100 mg/kg 鮮葉。該研究證明了通過向煙草嵌合動物外源P4H 酶，能使生產的重組人Ⅰ型膠原蛋白熱穩定性提高到37 ℃，提高產生膠原蛋白的質量。同時，該實驗首次在煙草中實現了農桿菌介導的瞬時表達體系，為植物瞬時表達系統的發展和廣泛應用提供了寶貴的經驗。

此后，重組膠原蛋白生產的植物表達體系發展迅速，2009 年以色列再生醫學公司CollPlant［70］成功將編碼人Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈、α2 鏈基因、P4H 基因、LH 基因以及靶向液泡蛋白基因在煙草體內實現共表達，生成的重組人Ⅰ型膠原蛋白表達量高達200 mg/kg 鮮葉，占煙草植物總可溶性蛋白的2%。與植物細胞核中靶向蛋白質表達占總可溶性蛋白的0.1%～1%相比，產量得到顯著提高，該公司也成為第一家成功開發出有效表達人體膠原蛋白植物平臺的公司，拓寬了重組人膠原蛋白在再生醫藥中的潛在應用。與此同時，Xu等［71］研發了單獨表達人Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子與同時表達人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H 基因的玉米種子，雖然同時表達人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H基因玉米種子中重組膠原蛋白含量（4 mg/kg）比單獨表達Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子重組膠原蛋白含量（12 mg/kg）低，但高分辨率質譜（HRMS）分析表明，同時表達玉米源性重組Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量為18.11%，與酵母性重組Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量的17.47%和人類原生Ⅰ型膠原蛋白的羥脯氨酸含量14.59%相當。與單獨表達Ⅰ型膠原蛋白基因的玉米種子與相比，同時表達人Ⅰ型膠原蛋白基因和P4H 基因玉米種子熱穩定性顯著增強，充分顯示了玉米具有生產充分修飾的外源蛋白的潛力。

2.4 昆蟲桿狀病毒表達體系

桿狀病毒表達體系通常由桿狀病毒作為表達載體感染昆蟲、幼蟲來獲得重組真核蛋白，已經被證實可用于重組糖蛋白的生產［75］。桿狀病毒表達體系與酵母表達體系相比，其背景干擾更低，進行翻譯后處理能力更強，生產的外源蛋白具有較好的三螺旋結構［86?87］。同時，蠶后腺細胞合成的特定蛋白質具有顯著活性：每個腺體中的大約1000 個細胞在4 d 內可生產高達300 mg 的蛋白質［88］，相當于每個細胞約80 μg/d 的蛋白質特定生產力。但是，利用昆蟲桿狀病毒產生膠原蛋白仍具有周期較長、產量較低的缺點。

Lambeig 等［72］通過構建桿狀病毒載體并生成重組蛋白病毒，利用BaculoGold 轉染試劑盒（Pharmingen）將重組pVL 構建物與改良的加州蜂核多角體病毒DNA 共轉染到Sf9 昆蟲細胞中，使Sf9 昆蟲細胞表達包含大量4?羥脯氨酸的具有三螺旋結構的人Ⅲ型前膠原蛋白α1 鏈。此外，在培養基加入抗壞血酸，將人Ⅲ型前膠原蛋白α1 鏈與人脯氨酰4?羥化酶的α 和β 亞基共表達，可使膠原蛋白熱穩定性從原先的32～34 ℃提高到40 ℃，并且在昆蟲細胞體內可表達出具有三螺旋結構Ⅲ型前膠原蛋白（60 mg/L）和Ⅲ型膠原蛋白（40 mg/L）。該研究為表達不同用途與結構的膠原蛋白提供了一種可行的方法。1997年，Myllyharju等［89］研究結果表明，無論是野生型還是重組型飛蛾細胞，人Ⅰ型前膠原蛋白α鏈的表達均以穩定的α1［Ⅰ］2α2［Ⅰ］前膠原異型三聚體和α1［Ⅰ］3同型三聚體存在，其表達量大約在10～20 mg/L，熱穩定性溫度在42～43 ℃之間，但不能形成α2［Ⅰ］3同型三聚體。同時，若將proa1［Ⅰ］鏈的信號肽和N 端前肽的編碼序列替換為前膠原蛋白α1［Ⅲ］鏈的編碼序列，可以提高前膠原蛋白α1［Ⅰ］鏈的表達水平；若將前膠原蛋白α2［Ⅰ］鏈上的C 端前肽替換為前膠原蛋白α1［Ⅰ］鏈或Ⅲ型前膠原的α1［Ⅰ］鏈，可形成同型三聚體，但該分子中的α2［Ⅰ］鏈在22 ℃下1 h后被胃蛋白酶完全消化。

2003 年，Tomita 等［74］嘗試通過轉基因蠶來實現重組膠原蛋白的表達。首先，通過構建包含刪除了C端前肽的人Ⅲ型前膠原蛋白迷你鏈、絲素輕鏈（L?chain）和增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的融合蛋白cDNA，并將該cDNA 整合到piggyBac 載體中，隨后利用粒子槍將其轉染蠶絲腺，使Ⅲ型前膠原蛋白分泌表達，每個蠶可以表達約70 mg融合蛋白質（純度達95%），蛋白組分簡單，便于后續重組膠原蛋白的純化。該實驗證明了蠶在工業大規模生產重組人膠原蛋白方面的可能性，證實轉基因蠶是生產重組人膠原蛋白的可靠工具。隨后經過13 年的努力，以蠶為宿主的重組膠原蛋白表達體系有了實質性發展。Qi 等［75］通過將含有人類Ⅱ型膠原蛋白cDNA 全部基因（4257 bp）的BmNPV?pFBDM?IM?colII桿狀病毒以注射的方式轉染到五齡蠶幼蟲背側血腔。結果發現家蠶所表達出來的Ⅱ型膠原蛋白存在著單螺旋α 鏈與三螺旋α鏈結構，蛋白分子量分別為130 kDa 和300 kDa。每個幼蟲蠶皮經鎳柱色譜純化可獲得大約1 mg 的具有一定活性的人Ⅱ型膠原蛋白，顯示出桿狀病毒?家蠶多基因表達系統可作為大規模生產表達活性人Ⅱ型膠原蛋白和其他復雜真核蛋白的方法。

2.5 哺乳動物細胞表達體系

哺乳動物細胞表達體系是利用哺乳動物細胞進行瞬時或穩定表達，或將重組蛋白基因整合到寄主基因組中構建的轉基因動物反應器［18］。應用最廣的細胞包括小鼠乳腺細胞、纖細肉瘤細胞和胚胎腎細胞［51，90?91］。而轉基因被譽為最有前途的動物細胞表達體系方法，該體系通過將cDNA轉基因序列與乳腺特異性啟動子結合，驅動牛乳腺中膠原蛋白的表達，重組膠原蛋白產量高達1 mg/mL［92］。轉基因哺乳動物細胞表達出的重組膠原蛋白或許能通過轉換等手段，彌補細胞表達體系產生的膠原蛋白不足的缺點，提高膠原蛋白產量。但哺乳動物細胞表達體系利用動物細胞直接產生蛋白質，對培養體系要求高，易受病毒感染。

Frischholz 等［76］通過人胚腎細胞系HEK293 和纖維肉瘤細胞系HT1080 穩定表達人α1［Ⅹ］全長cDNA，獲得表觀分子量為75 kDa、表達量為50 g/L的重組人Ⅹ型膠原蛋白，圓二色譜和胰蛋白酶/糜凝蛋白酶消化實驗表明，重組人Ⅹ型膠原蛋白存在部分羥基化，熱穩定性溫度低至32 ℃，證明了該表達體系具有產生三螺旋結構重組Ⅹ型膠原的潛力。隨后，Toman 等［77］構建了α s1 酪蛋白乳腺特異性啟動子的轉基因小鼠，該啟動子與37 kb 的人α1［Ⅰ］前膠原結構基因，在乳汁中檢測到高水平可溶性三聚體（高達8 g/L），并具有三螺旋結構。實驗證實，小鼠乳腺能表達出較大分子的前膠原蛋白結構，能作為重組膠原蛋白大規模生產的高效表達體系。HEK293 作為良好的瞬時表達體系，近年來由于重組蛋白藥物以及病毒的需要被研究學者廣泛應用。曾斐鴻［78］通過研究重組Ⅳ?α膠原蛋白在HEK293 細胞中的瞬時表達與穩定表達，發現HEK293細胞能通過瞬時表達體系穩定表達重組Ⅳ?α 膠原蛋白，產量可高達6.28 mg/L。此外，HEK293 細胞在培養過程中存在銅離子效應與乳酸代謝因素影響，這為工藝優化提供了依據。

3 膠原蛋白應用及研究展望

在國際上通常以專利數來衡量國家或企業的創新程度，截至2021 年，美國已公開的膠原蛋白相關專利擁有量為24 846件，授權專利量6452件，全球排名第一；歐洲與日本分別以專利量9317 件和5046 件分列全球膠原蛋白專利數二、三位。由此可知，各國膠原蛋白市場競爭激烈，美國具備巨大的專利優勢［93］。此外，膠原蛋白在國外已應用到人們生活的各個方面，如日本DHC、FANCL、UTU 等將膠原蛋白多肽應用到營養保健品以及美容上，其中光膠原營養保健品營業額可達15 億美元［93］。法國羅賽洛公司在歐洲、南美、北美以及亞洲開設了膠原蛋白生產和研發中心，先后開發了糖果、口服液、膠囊劑、粉末沖劑等一系列高端產品。在國內以“創新”為國家戰略，大力支持發展“生物基新材料”的大背景下，膠原蛋白吸引了越來越多參與者。國家食品藥物監管總局數據顯示，膠原蛋白相關的保健品已發展到191種，主要以膠囊、蛋白粉、片劑為主，含膠原蛋白的保健產品越來越受到大眾的喜愛與歡迎。同時，膠原蛋白相關產品也將在醫療、護膚等領域迎來巨大的發展，預計未來市場規模將達到5000億元。近幾年我國膠原蛋白尤其是重組膠原蛋白產業得到飛速發展，2022 年更是被譽為重組膠原蛋白爆發元年。重組膠原蛋白在我國不僅得到國家政策的支持與相關資金的幫助，還有強大的技術支撐。我國在重組膠原蛋白技術方面，已經在世界上處于非常領先的地位。我國膠原蛋白產品種類豐富，但與此同時，我國膠原蛋白技術研發領域仍然存在安全風險高和生物活性低等問題。我國市場監督體系仍然需要進一步完善，以避免宣傳效果與實際效果不符等現象。

重組膠原蛋白相較于傳統動物提取膠原蛋白，具有更高親水性、更高生物活性區域、更優異的抗氧化性能以及止血與促傷口愈合能力［18］。重組膠原蛋白自研發以來，在生物醫藥工程中得到廣泛的應用［52，94?96］。但是，由于機械強度有限，重組膠原蛋白主要應用于皮膚、眼科修復與心軟骨工程修復等方面［97?101］。

在皮膚治療上，Zhao 等［102］發明的MTGase 交聯重組類人膠原蛋白水凝膠具有良好的生物相容性，在動物實驗中也證實該材料具備較低的毒性，有望作為水凝膠注射材料修復皮膚損傷。Pan等［103］通過反復凍融聚乙烯醇、重組人類膠原蛋白與羧甲基殼聚糖的混合液得到水凝膠敷料，該敷料與商業敷料相比，能顯著促進全層皮膚傷口愈合，顯示了其作為皮膚創面愈合創面敷料的巨大潛力。Woodly 等［98］通過獲得重組人Ⅶ型膠原蛋白，將其遷移到隱性營養不良大皰性表皮松解癥患者的真皮?表皮交界處，有效預防皮膚起泡與糜爛的形成；Dong 等［104］在近年來證實將重組類人膠原蛋白與重組類人纖連蛋白聯合治療C57BL/6小鼠的急性傷口的效果高于兩者單獨治療效果，為重組膠原在皮膚治療修復方面開辟了嶄新道路。McLaughlin等［105］通過將重組人Ⅰ型膠原蛋白與重組人Ⅲ型膠原蛋白制成可注射生物材料，將二者注入到心肌梗死增殖后期的小鼠身上，發現使用重組人Ⅰ型膠原蛋作為注射材料可以有效促進愈合環境、心肌細胞存活以及減少心肌病理性重塑，有利于實現心肌梗死后重塑。

在眼科治療上，Fagerholm 等［106］利用重組膠原蛋白植入10 名圓錐角膜或角膜瘢痕患者，結果發現，所有患者淚膜得到恢復，基質細胞被招募到植入物中。還觀察到患者神經再生和觸摸敏感性恢復，與人類供體組織相比，兩者都達到更高的程度。通過進一步優化，生物合成角膜植入物可以提供一種安全有效的替代人體組織植入的方法，幫助解決目前供體角膜短缺的問題。隨后兩年，Fagerholm 團隊［107］開發了一種由碳二亞胺交聯重組人膠原蛋白組成的無細胞植入物，通過植入眼角膜細胞實現了角膜再生，在4 年多的時間里，再生的新角膜穩定整合在一起，無排斥反應，也沒有發生供體角膜患者所需的長期免疫抑制機制。實驗證明，由碳二亞胺交聯重組人膠原蛋白組成的無細胞植入物可以實現角膜的再生。因此，重組人膠原蛋白可作為良好的角膜修復植入物。

重組膠原蛋白與天然材料、合成材料、納米材料相結合的方式，能有效增強機械強度，控制生物降解，有利于骨修復。Song等［108］基于類人膠原蛋白制備海綿狀多孔水凝膠支架，該水凝膠可促進軟骨細胞的增殖與黏附，增強軟骨的修復，可作為軟骨組織工程的支架；Li 等［73］將重組類人膠原蛋白與納米羥基磷灰石相結合制備三維可降解多孔支架，可以承受（2.67±0.37）MPa 的壓縮應力，該支架能夠促進細胞黏附、均勻分布和豐富的GAG 合成，并保持天然軟骨細胞形態。Chen等［109］利用重組類人膠原蛋白與骨誘導劑（BMP）的結合，能有效促進大面積骨缺損后大鼠的全面康復，同時還發現重組類膠原蛋白能有效維持成骨誘導和骨形成的骨誘導劑劑量的微小變化。同時，Fan 等［110］制備了重組類人膠原蛋白與納米羥基磷灰石相結合的多孔復合支架，能有效提高骨組織工程的抗壓程度，該支架的抗壓強度和楊氏模量最大值分別為（2.97±0.19）MPa 和（43.03±6.17）MPa。

目前，重組膠原蛋白由于具有較好的生物相容性、更高的安全性以及對皮膚保濕修復明顯的特點，在膠原蛋白家族中占有重要地位。但目前重組膠原蛋白發展仍存在一些問題。為此，本文對重組膠原蛋白未來的發展有幾點展望：①現階段重組膠原蛋白的表達體系主要以大腸桿菌和酵母為主，利用大腸桿菌以及酵母所產生重組膠原蛋白雖然產量高，但大多數不具備三螺旋結構，研究高等動植物的重組膠原蛋白表達體系的相關報道較少，未來可以考慮利用動植物等生產高產的具有三螺旋結構的重組人源性膠原蛋白；②國內研究重組膠原蛋白大多數以工業生產為主，表達機制基礎研究較少，未來可深入研究重組膠原蛋白的不同表達機制，以期優化表達體系，提高表達產量和質量；③當前重組膠原蛋白純化工藝與技術仍有較大的提升空間。隨著分子生物學、蛋白質工程等的學科發展，重組膠原蛋白的研究將進一步深入，最終為生物醫藥領域提供更優質、更安全、更廉價的重組膠原蛋白原料。