電針治療通過NLRP3 減輕帶狀皰疹后神經痛線粒體功能的影響

袁志剛，吉斌，何俊辰，王晉

（天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津， 300120）

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）重新激活所引起。帶狀皰疹后遺神經痛（PHN）是最常見的并發癥[1]，發生在大約20%的患者身上。帶狀皰疹后持續至少90 d 以上的皮區疼痛被定義為PHN。線粒體功能異常會引起炎性反應和氧化應激，導致神經元的損傷和細胞凋亡，參與PHN 的發生發展。因此，保護線粒體功能可能是預防和治療PHN 的重要策略之一。PHN 治療的重點是控制癥狀，包括外用利多卡因、辣椒素以及口服加巴噴丁、普瑞巴林、三環類抗抑郁藥等，然而藥物不良反應使臨床應用受到了一定的限制。針灸的治療效果已經在臨床上得到了廣泛的應用，因為不良反應小，得到患者和醫生的認可。本研究觀察電針治療對PHN 線粒體功能的影響，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選擇 清潔級健康雄性SD大鼠54 只，8～10 周齡，體質量250～300 g，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心[許可證號SCXK-（軍）2009-003]。大鼠在12 h 的光/暗循環、單獨通風的環境中飼養，在適應環境3 d 后，用于實驗。將大鼠按隨機原則分為對照組（Con 組），模型組（PHN組）和模型+治療組（PHN+T 組）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型復制和處理 參照文獻[2]的方法，麻醉大鼠后，將解凍后的單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）株制成病毒懸液（濃度為106/100 μL，注射容積50 μL），注射到大鼠右后爪皮下，注射5 d 后皮膚出現帶狀皰疹樣皮疹，表現為玫瑰型疹子或透亮水皰和疼痛相關反應，表現為觸痛異常和機械性痛覺過敏。制模后PHN+T 組行電針治療，選陽陵泉穴、環跳穴電針刺激，進針3 mm，提插捻轉，連接電針儀，波寬0.1 ms，刺激強度1 mA，刺激頻率為2 Hz，均刺激0.5 h，連續7 d。

1.2.2 機械痛敏（MWT）和熱痛敏（TWL） MWT 的檢測采用von Frey filament 儀（Stoeling 公司，美國）測定右側后肢觸誘發痛閾值。具體方法：大鼠被關在一個有網眼地板的塑料籠子里1 h，以適應環境。用不同壓力的von Frey 纖維絲（從小到大0～60 g）以垂直于后爪足底表面方向刺激大鼠皮膚敏感處，每隔10 min 刺激1 次，重復3 次。當大鼠對von Frey 細絲的刺激做出反應，立即收回后爪時記錄壓力。去掉最大及最小值后取3 次的平均值代表機械性撤足閾值（PWT）。于注射前1 d、注射后7、14 和21 d分別測定PWT。為了避免研究者之間的錯誤，整個過程由同一研究者完成。

TWL 的檢測：在實驗前將大鼠在有機玻璃板上保持1 h 以進行馴化。大鼠左后爪受到不同強度紅外輻射刺激，直到其將爪子從地板上抬起。記錄從開始輻射到出現縮足反應的時間，每次照射間隔5 min，取5 次照射的平均值。

1.2.3 線粒體膜電位（MMP）檢測 于制模7 d 后取L4～5 節段脊髓背角，提取線粒體。用熒光染料JC-1（Beyotime，中國）測量MMP 水平。將線粒體與JC-1染料在37 ℃黑暗環境中孵育30 min。觀察到紅色和綠色熒光，并將該比率計算為MMP 值。

1.2.4 線粒體呼吸控制率（RCR） 于制模7 d 后取L4～5 節段脊髓背角提取線粒體，采用Clark 型氧電極技術測定線粒體呼吸功能。記錄線粒體狀態3 和狀態4 的呼吸，狀態3 與狀態4 的比率為RCR，以反映線粒體的呼吸功能[3]。

1.2.5 三磷酸腺苷（ATP）的檢測 于制模7 d 后取L4～5 節段脊髓背角，在冰上裂解，在4 ℃下以10 000 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min。采用商業ATP 測定試劑盒（Beyotime，中國）檢測上清液中ATP 水平，操作按劑盒說明進行。

1.2.6 活性氧（ROS）的檢測 于制模7 d 后取L4～5節段脊髓背角提取線粒體。用氧自由基敏感的DCFH-DA 探針（Beyotime，中國）測定線粒體中的ROS 水平。將線粒體與DCFH-DA 溶液在37 ℃下孵育30 min。用流式細胞儀（BD Biosciences）對其進行檢測ROS 的采集數量。

1.2.7 炎性因子的檢測 于制模7 d 后取L4～5 節段脊髓背角，制成組織勻漿，用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎性因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6]水平，操作按試劑盒說明書進行。

1.2.8 采用蛋白質免疫印跡試驗（Western blotting，WB）檢測NOD 樣受體蛋白3（NLRP3），IL-1β 和胱天蛋白酶-1（Caspase-1）的蛋白表達 各組于制模7 d 后取L4～5 節段脊髓背角提取蛋白質。使用BCA蛋白質檢測試劑盒（美國賽默飛世爾科學公司）對提取的蛋白質進行定量。采用WB 法檢測NLRP3，IL-1β 和Caspase-1 的蛋白表達以目的蛋白與β 肌動蛋白（β-actin）的比值表示目的蛋白的表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 統計軟件進行數據分析，所有計量資料均符合正態分布以均數±標準差（±s）表示，多組數據組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺治療對PHN 大鼠MWT 和TWL 的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠MWT 和TWL 閾值于首次注射后21 d 出現明顯的下降，在第7 天時為最低值（P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組從第7 天開始，MWT 和TWL 閾值開始明顯升高，第14 天和第21 天MWT 和TWL 閾值差異仍有統計學意義（均P<0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點行為學評分比較

2.2 針刺治療對PHN 大鼠線粒體功能的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠MMP、RCR 和ATP 均明顯降低，ROS 釋放增加（均P<0.05）；與PHN 組比較，PHN+T 組大鼠MMP、RCR 和ATP 均明顯升高，ROS釋放減少（均P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠線粒體功能的比較（±s）

表1 各組大鼠線粒體功能的比較（±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

組別n MMP（RFU） RCR（%） ATP（μmol/g）ROS（RFU）Con 組181002.8±0.50280±20100 PHN 組1860±15a1.2±0.25a140±10a550±50a PHN+T 組 1885±15b2.2±0.40b230±15b280±40b

2.3 針刺治療對PHN 大鼠炎性因子的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 含量均明顯升高（均P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6均明顯降低（均P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠炎性因子水平的比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠炎性因子水平的比較（pg/mg，±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

組別nTNFIL-1βIL-6 Con 組18 組18100± 10100± 10100± 10 PHN1200±100a1000±100a850±100a PHN+T 組18450± 50b440± 40b370± 20b

2.4 針刺治療對PHN 大鼠NLRP3 信號通路的影響 與Con 組比較，PHN 組大鼠NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 均明顯升高（均P<0.05），與PHN 組比較，PHN+T 組NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 均明顯降低（均P<0.05），見表3。

表3 各組大鼠NLRP3 和下游信號分子的比較（±s）

表3 各組大鼠NLRP3 和下游信號分子的比較（±s）

注：與Con 組比較，aP<0.05；與PHN 組比較，bP<0.05。

Caspase-1/β-actin Con 組180.16±0.020.16±0.0250.14±0.02 PHN 組180.59±0.03a0.47±0.12a0.40±0.10a PHN+T 組180.30±0.025b0.28±0.08b0.29±0.08b組別nNLRP3/β-actin IL-1β/β-actin

3 討論

PHN 是一種神經痛或復發性疼痛，通常是由于VZV 侵犯脊髓后根神經節的神經元所致[1]。線粒體功能異常和炎性因子反應在PHN 的發病機制中都扮演著重要的角色，并且二者之間存在著相互作用。線粒體是細胞內能量代謝的主要場所，而線粒體功能異常會導致神經元內能量供應不足，從而導致神經元代謝異常[4-5]。此外，線粒體功能異常也會引起神經元的氧化應激和影響神經元的凋亡過程，進一步加重PHN 的癥狀[3]。本研究結果與上述結論一致，模型組線粒體功能惡化，表現為MMP 下降，RCR 明顯降低，ATP 減少，ROS 釋放增加；針刺治療后，上述線粒體功能得到明顯好轉。

此外，炎性反應也參與了PHN 的發病機制，PHN 患者的神經系統會產生大量炎性介質，如細胞因子和趨化因子，這些炎性介質會導致神經元的死亡和神經元內環境的改變。同時，炎性反應也會導致線粒體功能異常的發生和加重，炎性因子介質如TNF-α 和IL-6 等可以抑制線粒體功能，增加線粒體內氧化應激程度，從而加重PHN 的癥狀。本實驗結果表明，模型組炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6明顯增加，炎性因子反應惡化，針刺治療后，炎性反應減輕，表現為TNF-α、IL-1β 和IL-6 的過量釋放被抑制。

NLRP3 通過促進炎性因子反應在PHN 中發揮作用。VZV 感染后，機體會釋放IL-1β、IL-6 和TNF-α多種炎性介質等，導致神經炎性因子反應和神經元損傷，從而引發PHN。在PHN 中，NLRP3 被激活后可以誘導IL-1β 的分泌，從而加劇炎性因子反應，進一步損傷神經組織。有研究表明，在PHN 患者中，IL-1β 和NLRP3 的表達均明顯升高，提示NLRP3介導的炎性因子反應可能是導致PHN 發生的重要機制之一[6]。本研究顯示，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達趨勢與上述結論一致，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達增加；針刺治療后，NLRP3 及其下游信號分子IL-1β 和Caspase-1 的表達下降，與炎性因子的反映趨勢一致。

綜上所述，線粒體功能異常在PHN 的發病機制中起著至關重要的作用，可能是PHN 的重要發病機制之一。未來的研究可以進一步探討線粒體功能異常與PHN 之間的關系，以便更好地理解PHN的發病機制，為PHN 的治療提供新的思路和方法。