甘草酸抑制腫瘤的網絡藥理和分子對接分析

郭偉強， 吳天惠， 陳子明， 張 杰， 張佳鈺， 胡翠英， 秦粉菊

（蘇州科技大學化學與生命科學學院，江蘇 蘇州 215009）

癌癥是排位第二的死亡原因，嚴重危害人民群眾的身心健康。 據統計，2022 年，美國新發腫瘤195 多萬例，新增死亡病例接近61 萬；而我國新增406.4 萬例癌癥患者，且我國惡性腫瘤發病率高于全球平均水平[1-2]。 目前，腫瘤治療仍以手術、化療、放療及靶向治療為主，但化療和靶向治療的耐藥現象以及毒副作用等因素使得患者難以獲得較為合適的治療效果。 因此，探討找尋更加有效且安全的治療藥物或方法極具臨床意義和價值。

中草藥是中華民族的傳統瑰寶，其療效在長期的實踐中已得到確認，從中草藥中尋找有活性的成分是藥物開發及先導藥物篩選的有效途徑和捷徑[3]。 甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA，如圖1 所示），屬五環三萜類化合物，是甘草中含量最高、生物活性較強的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用。 已有研究發現，GA 通過抑制SIRT3、ROS、AKT 等通路實現抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡等作用[4-6]。 雖然GA 的抗腫瘤活性和作用機制研究取得一定的成果，但由于中藥成分存在著多靶點、多作用通路現象，深入全面地分析其作用靶點和作用機制具有重要意義。

圖1 甘草酸結構式

隨著生物信息學、系統生物學、分子藥理學等科學的飛速發展，建立在組學和多向藥理學基礎上的網絡藥理學備受關注。其已被廣泛應用于天然產物的活性成分分析、作用靶蛋白找尋和藥理機制詮釋之中，極大地促進了藥物發現和重定位[7]。 文中研究基于網絡藥理學方法，經反向對接預測、GO/KEGG 富集分析、蛋白-蛋白互作用分析、分子對接驗證等，預測分析GA 抗腫瘤的作用機制和潛在作用靶蛋白，為以GA 為先導物的抗腫瘤藥物開發提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 GA 的靶蛋白預測

利用Super-PRED 數據庫中的Target Prediction 模塊（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）導入GA 結構式，預測其潛在作用靶蛋白，隨后將預測結果保存，以便后續分析。

1.2 相關疾病分析和抗腫瘤靶蛋白的篩選

將上述所預測的潛在靶蛋白輸入CTD 數據庫（ctdbase.org/about/），根據醫學主題詞的疾病分類，篩選獲得癌癥的相關條目，得到GA 相關的潛在抗腫瘤靶蛋白。

1.3 “GA-靶蛋白-腫瘤”網絡構建

以GA、 潛在抗腫瘤靶蛋白和對應癌癥類型等為節點， 在Excel 中建立彼此對應關系， 隨后導入Cytoscape 軟件中，利用Network Analyzer 插件構建“GA-靶蛋白-腫瘤”藥理網絡。

1.4 GO、KEGG 富集分析

為進一步分析GA 的抗腫瘤潛在作用機制， 將GA 的潛在抗腫瘤靶蛋白輸入DAVID 在線分析系統，將研究對象限定為人，進行GO、KEGG 富集分析，并借助Omicshare 在線平臺所得通路構建氣泡圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

在STRING 數據庫（www.string-db.org）中，輸入GA 的抗腫瘤靶蛋白進行在線分析，研究物質限定為人，數據導出為TSV 格式，隨后利用Cytoscape 構建GA 抗腫瘤靶點的PPI 網絡。

1.6 分子對接驗證

為進一步驗證GA 與潛在靶蛋白的結合能力，采用iGEMDOCK 分子軟件進行對接分析。 首先，從PDB數據庫（www.rcsb.org）中下載GA 相關靶蛋白的晶體結構，并用Autodock Vina 去掉多余的分子、加氫等，將其轉換為Pdbpt 格式。 隨后，進行對接分析，并使用Pymol 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 GA 的靶點預測分析

經Super-PRED 數據庫中的Target Prediction 模塊預測，得到110 個GA 的潛在作用靶蛋白，見表1。 將所得到的110 個靶蛋白，通過CTD 數據庫分析，篩選得到56 個與腫瘤相關的靶蛋白和41 種腫瘤類型相關。隨后，借助Cytoscape 構建“GA-靶蛋白-腫瘤”網絡圖進一步對GA、與腫瘤相關靶蛋白及腫瘤類型之間的關系進行可視化分析（如圖2 所示）。 這些預測結果表明，GA 在乳腺癌、肝癌、非小細胞肺癌、腸癌等多種腫瘤中具有抑制活性和治療作用。

表1 甘草酸反向對接結果單位：%

圖2 GA-靶蛋白-腫瘤的網絡

2.2 腫瘤相關靶蛋白的GO、KEGG 富集分析

使用DAVID 數據庫對GA 的56 個抗腫瘤靶蛋白進行GO、KEGG 富集分析。如圖3（A）所示，GO 富集結果顯示，positive regulation of angiogenesis （正調控血管生成）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）、vascular endothelial growth factor-activated receptor activity（血管內皮生長因子激活受體活性）、positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade（ERK1 和ERK2 級聯正向調節）等與GA 的關聯度較高、P 值較低。 KEGG 富集分析發現，GA 的腫瘤靶蛋白富集于PI3K/AKT、HIF-1、JAK/STAT 等通路（如圖3（B）所示）。此外，筆者發現GA 也與EGFR 抑制劑耐藥存在關聯。上述結果表明，GA 可能通過作用于多靶點、調控多通路發揮抗腫瘤作用。

圖3 GA 潛在抗腫瘤靶蛋白的GO 和KEGG 通路富集分析

2.3 腫瘤相關靶蛋白的PPI 分析

將經CTD 數據庫篩選后的GA 潛在抗腫瘤靶蛋白輸入STRING 數據庫， 得到GA 潛在靶蛋白之間的相互作用網絡，使用Cytoscape 軟件，根據“degree”進行進行PPI 網絡繪制和優化。 該網絡中含有53 個蛋白（GPR55、HSD17810、CNR2 等3 個蛋白與其他蛋白未發生互作，故未在該網絡中顯示），159 條邊；節點中字體的大小代表“degree”的大小。 因此，由圖4 可知，HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等蛋白在該網絡中占據重要地址，表明這些蛋白可能是GA 的抗腫瘤關鍵蛋白。

圖4 GA 抗腫瘤靶蛋白的蛋白-蛋白互作網絡

2.4 GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的分子對接驗證分析

為進一步驗證HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白是否為GA 的潛在抗腫瘤關鍵蛋白， 使用iGEMDOCK 分子對接軟件進行對接分析。對接結果顯示，GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的結合能分別為：-98.2、-111.7、-132.9、-135.9 kcal·mol-1。

如圖5 所示，GA 與HSP90AA1 活性口袋中的ASN51、ILE96、GLY97、ASN105、GLY108 等位點產生氫鍵或范德華力結合；GA 與PI3KR1 的ARG770、GLU798、ARG852、ASP933 等位點產生結合， 這些位點處于PI3KR1 的功能域之中；GA 與mTOR 的磷酸化活性區域中的ILE2163、LYS2171、VAL2183、TRP2239、PHE2184 等氨基酸產生作用；GA 與STAT3 的SH2 區域產生結合， 結合位點為LYS591、SER611、GLU612、SER613、THR620 等。 這些結果說明GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等有很好的結合，且對接結果與反向對接預測相一致。

圖5 GA 與潛在抗腫瘤靶蛋白的分子對接驗證

3 討論

近年來，GA 的抗腫瘤活性和作用機制不斷被發現。Wang 等人發現GA 在結腸癌細胞中可有效抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡[8]。 Tsai 等在肝癌體內外研究中證實GA 通過抑制PKB 誘導凋亡[6]。 上述研究顯示了GA 在抗腫瘤治療中的潛在應用價值，但其作用機制和潛在作用靶蛋白仍有待深入。 由此，文中通過網絡藥理和分子對接驗證發現，HSP90AA1、MTOR、PI3KR1、STAT3 等可能是GA 抗腫瘤的關鍵靶蛋白。

HSP90AA1 是熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）家族的重要成員之一，其在諸如肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在高表達，是腫瘤檢測和治療的重要靶點之一[9-10]。 Xiao 等在骨肉瘤細胞中發現HSP90AA1 不僅能夠調控細胞增殖和轉移，還參與調控細胞自噬以及化療耐藥等過程[11]。 HSP90AA1 在腫瘤細胞中的調控作用依賴于下游HIF-1α、AKT 和ERK 等信號通路[12-13]。 結合KEGG、GO 富集結果可以發現GA 可能通過靶向HSP90AA1 調控PI3K/AKT、HIF-1α、ERK 等通路實現抗腫瘤作用。

I3KR1 是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調節亞基p85α，當上游因子與p85α 結合后，將進一步激活PI3K的磷酸化。 Zhang 等人在胃癌中證實miR486-5p 通過負調控PI3KR1 抑制PI3K 磷酸化及其下游因子AKT[14]。 Lin 等研究發現PI3KR1 在三陰性乳腺癌中存在著高表達，且與AKT3 的磷酸化存在著密切相關性[15]。 GA 的相關藥理研究顯示，其可通過抑制PI3K/AKT 通路實現抗炎和抗腫瘤作用[16]。 故，PI3KR1 可能是GA 抗腫瘤作用靶蛋白之一。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR），屬非典型高保守絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 具有調控細胞的增殖、 生長、 自噬等作用。 在哺乳動物中，mTOR 主要有兩種存在形式：mTORC1 和mTORC2，但mTOR 的大部分功能來自于mTORC1。當上游因子AKT 活化后，磷酸化TSC2 使TSC1-TSC2 復合物解離，從而激活mTORC1，進而磷酸化真核翻譯起始因子4E 結合蛋白1（4EBP1）、S6 激酶（S6K） 和固醇調節元件結合蛋白（SREBP），以促進蛋白質翻譯，并抑制自噬過程。此外，Son 等還發現mTORC1 的?；材苷{控自噬過程[17]。 因此，mTOR 成為抗腫瘤藥物篩選的重要靶點之一。 Wang 等發現二甲雙胍通過抑制mTORC1 和mTORC2 雙通路實現誘導自噬和細胞周期阻滯[18]。Allen 通過計算機高通量篩選發現桂利嗪和氫化嗪類化合物是mTORC1 的潛在抑制劑[19]。 研究結果表明，GA 能與mTORC1 產生結合，進而發揮抗腫瘤作用。

信號轉導和轉錄激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），位于人17 號染色體q21.2，由約750～850 個氨基酸組成，包含：DNA 結合域（DBD）、SH2 結構域、羧基端轉錄激活區域等功能結構域。 臨床病理研究顯示，其在多種惡性腫瘤中存在高表達、高活性。 因此，STAT3 被認為是腫瘤診療、發病機制、治療藥物開發等領域的重要因子之一[20]。 針對STAT3 抑制劑的開發和找尋主要集中于上游信號因子的阻斷，或直接針對性抑制其SH2、DBD 等功能域或抑制其的表達等方面。 紅景天苷被證明通過與STAT3的DBD 結合，從而阻斷STAT3 與Nanog、MMP2 等基因的啟動子的結合而發揮其抗三陰性乳腺癌的活性[21]。此外，抑制STAT3 的乙?；渤蔀镾TAT3 抑制劑開發的新思路。 如，一種新合成的咔唑——SH-I-14，通過抑制STAT3 乙?；?，破壞DNMT1-STAT3 相互作用，導致DNA 去甲基化和腫瘤抑制基因的重新表達[22]。 分子對接結果顯示，GA 可能是STAT3 的潛在抑制劑，其與STAT3 的SH2 區域產生結合，進而抑制STAT3 磷酸化。

4 結語

論文利用網絡藥理學相關方法深入分析了GA 抗腫瘤的潛在作用機制和作用靶蛋白， 結果表明GA 可作為治療多種實體腫瘤的潛在藥物。該研究為GA 的藥理研究、臨床應用提供了重要的理論參考，也為以GA為先導物的靶向抗腫瘤藥物的開發提供了一定的技術支撐。