園林廢棄物堆肥復配菌劑的研究進展

錢 瑋， 陳 新， 陳宏偉， 高 宇

（1.蘇州科技大學化學與生命科學學院，江蘇 蘇州 215009；2.張家港市園林苗圃園林科技研究所，江蘇 蘇州 215600）

近年來，隨著城市外擴步伐的不斷推進，城市綠化也得以快速發展。園林廢棄物作為重要的生物質原料，其體量逐年增加[1]。因此，如何高效實現廢棄物的資源化與清潔生產已受到廣泛關注[2]。目前對于廢棄物堆肥化處理的研究，主要集中于外源微生物菌劑的研制，以期改善堆體微生物的豐富度與多樣性，從而構建出更多的降解酶系來完成對物料的選擇性破壞，使之成為可再生利用的資源[3-4]。 自20 世紀40 年代以來，我國彭家元與陳禹平就通過添加高溫富集培養出的纖維分解菌，短時間內實現了物料腐熟，為我國農業積肥造肥開辟了新道路。 但早期此類菌劑微生物較為單一，功能菌株抗逆性不足且很難長時間維持較高活性，因此，以復配菌劑作為堆肥的外源添加物已逐漸成為近年來的主流趨勢[5-6]。 如席北斗[7]等在生活垃圾中添加的復合菌群（固氮菌、酵母菌、纖維素分解菌等），可使堆體溫度24 h 上升至68 ℃，15 d 內有機物下降33.3%，腐熟時間也同比縮短了18 d。 Hou T[8]等將耐熱的硝化細菌和硫氧化細菌復合加至污水污泥中進行堆肥，從而提高了生境中氮硫代謝的關鍵酶活與元素轉化。 Zheng W[9]等研究表明添加蚯蚓糞和生物炭使秸稈堆肥中不動桿菌相對豐度增加，細菌群落Shannon 和Pielou 指數分別增加了9.42%和9.33%，實際應用中黃瓜增產達46%。因此，為了園林廢棄物的高效利用，從而深入復配菌劑的探究，促使其在堆肥過程中協同發揮出更為顯著的效果具有重要意義。

1 復配菌劑的研制

園林廢棄物是一種富含木質纖維的堆肥材料，其中大量的木質素與半纖維素牢固地結合在一起，將纖維素致密地包裹起來，從而嚴重影響了微生物的降解與外界氧化[10-11]。 同時，其強烈的季節性與空間異質性，也直接阻礙了園林廢棄物專用菌系的研制。 因此，通過合適的方法構建出一組關于木質素纖維素降解能力強的復合菌系，已成為園林廢棄物高溫快速堆肥的關鍵所在。 目前復配菌劑的研制方法主要包括：

1.1 功能菌株的組合

功能菌株的組合是指研究者根據自己的實驗意圖，選擇一些已知的菌株或從堆肥物料中篩選的功能菌進行優化組合，從而得到一組針對性較強的復合菌劑[12]。 目前常見的組合方式有：①根據菌株的不同功能進行復配，如何慧中[13]等通過3 株具有木質素降解能力的真菌與7 種營養菌進行組合，發現菌群間可以彼此協同、聯合作用，既能實現對外界環境的快速適應，又可完成對木質素的高效降解；②利用統計學方法（正交設計、均勻設計等）重組菌劑，如尹爽[14]等通過正交試驗對不同菌株的比例、發酵時間與溫度進行探索，從而得出S-3 菌株與白腐菌等比混合而成的復合菌劑，在30 ℃條件下發酵17 d 的作用效果最佳，其對纖維素和木質素的降解率分別可達35.60%和37.41%；③根據自然狀態下的原始比例配制菌劑，如李天樞[15]等將不同溫度下所分離篩選的菌株按照自然比例進行增殖和復配，由此而來的菌劑升溫迅速，且對碳、氮的固定效果皆優于市場所售菌劑。

1.2 直接篩選法

直接篩選法擺脫了復合菌劑以純培養手段為基礎的固有模式， 是一種通過對特定時期的土著微生物進行富集或連續傳代馴化，使之保持原有的協同關系而對物料產生降解效果的研制方法。其主要操作包括：①擴大培養，如徐智[16]等將特定環境下的堆肥原料直接接種至液體培養基中震蕩培養， 使其有效活菌數達到理想數量級的培養物作為內源復合菌劑。研究表明，接種該菌劑的物料升溫迅速且腐熟效果明顯優于外源菌劑。 ②連續傳代馴化培養，如崔宗均[17-18]等將高溫階段的物料接種至含濾紙的蛋白胨纖維素培養液（PCS）中，50 ℃下靜止培養。 當浸在培養液中的濾紙條剛要斷裂時，將其轉接至相同的新鮮培養液中，重復傳代數次，最終得到一組纖維素分解能力強的復合菌系MC1。 該菌系4 d 內對稻草秸稈的降解率可達60%以上。 ③腐料回用，如宋修超[19]等將堆肥腐熟后的物料直接作為復合菌劑，并將其添加至新的堆肥處理中。 結果表明，腐料使得堆肥的高溫期提前了20 d，且平均溫度同比上升了5 ℃左右。 兩種復配菌劑研制方法的比較見表1。

表1 兩種復配菌劑研制方法的比較

2 復配菌劑在堆肥中的群落結構演替研究

2.1 宏基因組學的應用

微生物的群落結構是動態變化的，它們與環境變量息息相關，其中劣勢菌株因生長限制而被相繼淘汰。相反，其他菌株卻因此優勢代之，最終達到一個相對穩定的狀態。 故在針對復合菌劑的研究過程中，有必要采取一種合適的分析方法，用以揭示堆肥各階段的群落結構以及演替規律，為菌劑微生物的后續影響提供一定的理論依據。

傳統的分析方法是建立在分離與培養的基礎上，通過對純種微生物的形態特征或顯微觀察來了解群落結構的分布情況[20]。該方法操作簡單、廉價，但由于培養基和培養條件的限制，目前可通過此法鑒定的微生物僅占環境總量的0.1%～10%，這顯然不足以描述自然條件下群落結構的真實狀態[21]。

宏基因組學技術是一種不依賴于傳統微生物的分離與培養，而是直接通過提取環境樣品中所有微生物（可培養、不可培養的活菌以及未降解的死菌）完整的遺傳學信息，并經過合適的載體將其轉運至穩定表達的宿主細胞中，以實現對所需目的基因的篩選[22-23]。 同時，隨著高通量測序與分子鑒定技術的飛速發展，使得宏基因組學在挖掘有效生物學信息的過程中具備更加準確、全面、可操作性等優勢，從而充分保障了后續微生物的種屬鑒定以及相應功能的預測， 全面闡釋了各群落結構間的差異性或與環境因子間的關聯程度。 如Nagata N[24]等利用宏基因組鳥槍法對胰腺導管癌（PDAC）患者的腸道和唾液進行了研究。結果發現，患者樣本中的物種組成與相對豐度在疾病早期就已出現嚴重失調。進一步說明了PDAC 對腸道和口腔微生物的影響。Du C[25]等通過構建宏基因組文庫對岱海湖沉積物中抗生素抗性基因（ARGs）和金屬抗性基因（MRGs）的多樣性進行了研究。 其中共鑒定分析出了16 種ARGs 類型（主要是桿菌肽、鏈霉素、四環素、β-內酰胺和磺胺的耐藥基因）與15 種MRGs 類型（主要為多金屬耐藥基因），從而解釋了湖泊生境中的多種抗性行為。

2.2 群落結構及演替規律

2.2.1 復配菌劑的影響

在微生物的群落組成與演替規律的探索過程中，宏基因組測序技術向研究者提供了更加全面準確的信息。研究表明，復合菌劑的施加對原始微生物的群落組成有著顯著影響。其中真菌對環境變化的適應能力較弱，往往在物種組成的方面表現出比細菌更大的差異性[26]。而相比之下，細菌的多樣性受接種的影響較小，整體呈現出比真菌更多的種類和數量，這是由于細菌可利用的資源廣，遇復雜因素的抗性強[24]。 而在園林廢棄物的堆肥過程中，菌劑的添加也同樣對微生物的群落演替造成了影響。如夏金利[28]等通過對堆肥樣本的PCA分析發現，各處理中真菌的群落結構因菌劑的施加而出現了明顯差異，這種差異隨時間的延長而逐漸減小，10 d 后幾乎消除。但細菌群落卻與此相反，在前期物料升溫的過程中，像Sphingobacterium、Thermobifida 等具有木質纖維降解能力的優勢菌屬在各處理中基本呈現出相同的變化趨勢，而中后期僅能在含菌劑的物料中被檢測到。 同樣，Liu[29]等通過高通量測序技術對園林廢物堆體中的細菌多樣性進行了全面分析，結果表明菌劑的施加改變了堆肥中期細菌的演替方向，在此階段中各處理的多樣性指數（Shannon）最大，物種差異最為明顯，從而進一步驗證了菌劑對生境微生物群落的影響。

2.2.2 不利因素的影響

總體而言，復合菌劑的施加賦予了微生物更高的能量代謝與物質降解效率[27，30]。 但是，堆肥系統中群落的組成通常也會受到許多不利因素的干擾而導致理想的演替方向出現偏差，最終致使所呈現出來的菌劑效果微乎其微，甚至完全失敗[31]。 如Xi[32]等認為，菌劑與土著微生物之間的競爭關系將會引起某些功能菌株的衰退，從而導致優勢種群的多樣性降低、菌劑的作用效果減弱。 同樣，Zhao[33]等指出物料中殘留的抗生素也會抑制菌劑微生物的數量與活性，從而造成肥力的大量損失。 另外，更為關鍵的因素在于園林廢棄物的本質是一種富含木質纖維素的堆肥材料。 其在未經任何處理的條件下，僅憑微生物的降解作用是很難打破木質素和半纖維素之間的屏障，而使纖維素從中釋放出來并轉化為可發酵利用的糖。 最終大部分功能菌株由于營養匱乏而導致種類和數量急劇減少，引起發酵失敗[34]。 因此，研究者必須采取相應的措施消除不利因素的影響（見表2），以確保功能菌株能隨著群落的正常演替而發揮積極作用。

表2 生境中不利因素的消除措施

2.2.3 溫度變化的影響

高溫好氧發酵是園林廢棄物菌劑快速堆肥的典型特征。 在保證氧氣含量充足的條件下，微生物群落將會隨著溫度的變化而不斷進行自我調節與生態位的分離，以實現群落演替[12，29]。 而對于堆肥的不同階段，功能菌株的種類和數量越多，木質纖維的降解酶系就越豐富，反應速率就越快[43]。因此在施加復合菌劑后，系統中微生物群落結構的變化趨勢應盡量符合物料溫度的整體走向，以確保每個階段的生物活性都維持在一個較高的水平。

（1）升溫階段。 堆肥初期，微生物優先利用各種可溶性有機物（脂肪、單糖和碳水化合物）進行生長繁殖并釋放熱量，從而引起堆體溫度的迅速上升。 在此階段中，微生物的種類和數量極為豐富（細菌、放線菌、真菌），其中主要以中溫、好氧型為優勢菌群[43]。 雖然這些菌類都具備有機物的分解能力，但對于不同化合物的親和程度卻有所差異。 如在園林廢棄物堆肥的升溫階段，主要的優勢細菌為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（proteobacteria）等，這是因為它們能有效吸收糖類等易分解的物質[28-29，44]。 相比之下，真菌的多樣性卻遠低于細菌，大致與放線菌相當。 其中主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）等，它們在降解纖維素、木質素方面表現出超強的效果[28，44]。

（2）高溫階段。當物料溫度上升至50 ℃以上時，即可認為進入高溫階段[43，45]。 此時，生境中的物種多樣性與豐富度發生了顯著變化，它們整體朝著嗜熱性的方向進行演替。 在此階段中，嗜熱性細菌和放線菌的代謝活動逐漸加劇，存在明顯的優勢種群地位。 而大多數真菌受高溫抑制甚至死亡，僅部分耐高溫的真菌（Thermomyces dupontii、Thermomyces lanuginosus、Thermophilic sporotrichum）開始大量增殖且對木質素、纖維素等復雜化合物表現出強烈的降解能力[46-47]。 而當溫度繼續升高至60 ℃以上時，生境中幾乎所有的真菌完全停止活動，此時嗜熱性細菌與放線菌（Acidothermus cellulolyticus、Bacillus subtilis、Rhodothermus marinus、Thermobifida fusca）占據主導地位，繼而對一些難降解的有機化合物加以分解并開始腐殖質的形成[46，48]。

高溫期是園林廢棄實現快速堆肥并獲取高品質腐料的重要階段。 在此過程中，功能性微生物不僅代謝活躍，對木質纖維表現出超強的降解能力。 同時，高溫等物理條件也促使了大分子復雜化合物的結構裂解，使得大量芳香類物質得以釋放，為腐殖質的合成提供了更多前體，有利于后期生物途徑（微生物合成、細胞自溶）與非生物途徑（美拉德反應、多酚自縮合等）對腐殖質的積累[49]。因此有必要通過宏基因組學技術，全面獲悉堆肥各階段的群落演替規律，從而階段性補足不同時期的功能性微生物（見表3）。 特別在高溫階段，通過添加合適比例的嗜熱性微生物，這對有效解決園林廢棄物堆肥周期長、降解不徹底的問題具有重要意義[35]。

表3 不同物料中的功能微生物

（3）腐熟階段。 當溫度持續下降并穩定維持在40 ℃左右時，堆肥進入腐熟階段[12]。 此時園林廢棄物中可利用的有機物基本完成了礦質化和腐殖化， 體系中僅剩下一些較難分解的殘留物以及新合成的腐殖質[3，15]。此時，由于營養的嚴重匱乏以及對溫度環境的不適應，大量嗜熱性微生物的多樣性與豐富度開始逐漸降低。而那些經過高溫期殘留下來的中溫細菌、真菌、放線菌又重新活躍起來并再次恢復優勢地位，進而對上階段的難降解物質繼續分解、腐殖。

3 復配菌劑的群落結構的影響因素研究

如今，隨著鑒定技術與數據處理能力的飛速發展，環境因素與物種之間的聯系也越加明確。 研究者可通過對相關影響因子（如：原料含水率、C/N 比、氧氣濃度、pH 值等）的定向調控，以確保復合菌劑的高效作用。

3.1 含水率

含水率是指示堆肥特性的一個重要參數，如果含水率過高，物料各組分間的空隙將會被水膜填充，導致堆體供氧不足而形成厭氧狀態，并產生惡臭。 同樣，過低的含水率也將嚴重阻礙微生物的生長繁殖、物質交換以及代謝速率，甚至導致整個堆肥工藝的失敗[52]。目前大量研究表明，堆肥的起始含水率控制在50%～60%最為適宜[43，45]。 但由于園林廢棄物中結構致密的木質纖維素對水分的持有能力較弱，往往會引起堆體底部積水，不利于好氧發酵[53]。因此還需通過翻堆或加入表面活性劑等措施加以改善[54]。

3.2 C/N

園林廢棄物的C/N 比隨組分、地域、季節而變化，整體呈現出高碳低氮的性質（見表4）。 理論情況下，微生物每消耗25 g 碳便需要吸收1 g 氮[43]。但當物料中的C/N 比過高時， 微生物則需要經過多次生命循環才能氧化掉多余的有機質，進而延緩了堆肥進程。 若C/N 比過低，則過量的氮素又將以氨氣的形式流失，致使物料肥效下降。 通常來說，堆肥材料的初始C/N 比控制在25%～30%范圍內最為適宜[12，55]。 因此對于園林廢棄物的前期預處理，可以選擇一些含氮量較高的經濟來源物（見表5）進行調節。

表4 常見園林廢棄物的理化參數

表5 常見高氮物料的理化參數

3.3 pH 值

pH 值是影響微生物代謝活動的重要因素之一，其大小隨溫度和時間的變化而變化。一般認為，中性或弱堿性為微生物堆肥發酵的最適環境[43，45]。當pH 值過高或過低時，可通過翻堆或加入一些中和藥劑進行調節，以避免微生物的生長繁殖和有機物的降解受到抑制。 但由于堆肥系統本身存在一定的自我緩沖能力，故在實踐操作中很少專門針對pH 值進行調控[52]。

3.4 氧氣濃度

充足的氧氣供給是實現園林廢棄物高溫快速堆肥的關鍵所在。 研究發現，堆體的溶氧濃度維持在8%～18%范圍內最為適宜[64-65]。若通氣太旺，則會引起微生物的活動加劇，致使營養物質以及水分嚴重流失。同時，熱量的大量散失也將導致底物中的蟲卵和病原菌無法有效殺滅；相反，若溶氧濃度低于8%時，堆體內部又將形成厭氧環境，從而產生惡臭并影響堆肥質量。 因此，研究者往往根據堆層中的氧氣濃度和耗氧速率，以翻堆、表面自然擴散或強制通風等方式對系統中的溶氧濃度加以調控[52]。 但值得注意的是，在通風供氧的過程中，應充分考慮物料密度與空隙的最大飽和度，以避免造成溫度的大幅度變化。

3.5 溫度

溫度是微生物活動強度的最好反映。 在堆肥初期，堆體中的嗜溫菌較為活躍，能迅速利用物料中的可溶性有機物并釋放出熱量，引起溫度的不斷上升[66]。 當溫度到達55 ℃左右時，堆肥進入高溫好氧階段。 此時嗜溫菌的生長活動受到限制甚至死亡，而嗜熱菌的繁殖進入激發態，一些復雜難分解的有機化合物（半纖維素、纖維素、木質素等）也開始逐漸降解[12]。 但高溫不宜超過60 ℃，否則將導致大部分微生物的代謝活動停止，僅剩下部分嗜熱菌[52]。 因此，一般認為高溫階段最好在55～60 ℃范圍內，并維持3 d 以上，這樣既能保證堆體微生物的豐富度和多樣性，又能達到無害化處理的標準[52，67]。

4 結語

添加外源復配菌劑的堆肥化處理因其綠色、環保、經濟效益大等顯著優勢，現已廣泛實踐應用于園林廢棄物的資源化再利用。 但由于物料自身高C/N 比、親水性差、透氣性不足、高分子化合物（如纖維素、木質素等）難降解等特性，這對未來復配菌劑的模型構建、特性優化以及相關配套設備與工藝提出了更高的要求。相信隨著研究的深入和產業化應用，復合堆肥菌劑能夠為園林廢棄物的科學化、綠色化、安全化處理提供強有力的支持，能夠有效改善園林廢棄物堆肥效率低的問題。