CUMS 抑郁小鼠模型海馬氧化損傷的研究及大黃酚的保護作用

蔡依琳，朱樂玫，陳彬，李千喜，陳光領

（長沙醫學院，湖南長沙 410200）

抑郁癥是最常見的精神障礙疾病之一，對患者的身心健康具有嚴重影響，全球約有三億人受到抑郁癥的困擾且發病率逐年上升[1]。抑郁癥具有高患病率、高復發率和高致殘率的特點，對患者家庭及社會帶來了沉重的經濟和心理負擔[2]。

目前為止，抑郁癥以藥物治療為主，盡管進行了充分的藥物治療，仍有約1/3 的患者不能達到臨床痊愈的效果?，F在市場上代表性的抗抑郁西藥種類有限，機制不清晰，且存在復發率較高、副作用大和停藥易復發等缺陷[3]。中藥具有資源豐富、療效準確、副作用較小的優勢，因此進一步尋找治療抑郁癥的中藥，發揮中藥在治療抑郁方面的獨特優勢是中國醫藥事業的一項重任。

大黃酚（Chrysophanol，CHR）是從中藥大黃、何首烏和虎杖中提取出來的具有多方面生物治療潛力的蒽醌類有效單體[4]，國內外許多研究表明其具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗炎、神經保護及改善學習認知功能障礙的作用[5]。特別是大黃酚的神經系統保護作用在近年來備受關注，既往研究表明，大黃酚通過抗氧化、抑制膽堿酯酶活性、提升抗氧化酶活性[6-7]、抑制神經元凋亡[8]等作用保護神經及改善學習記憶障礙。但是，大黃酚對由慢性不可預見性溫和應激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）誘導抑郁癥狀的小鼠是否具有行為學的改善作用和有神經保護功能以及其具體的分子機制，目前尚未見報道?；诖?，本研究用CUMS 法來建立小鼠的抑郁模型，探討大黃酚對抑郁癥行為學改善作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H2050R 高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；EL104 萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；ELx800 全自動酶標儀，美國BioTek公司；3-30K 微量高速離心機，德國Sigma 公司。

大黃酚（純度＞98%，批號：AF21022853），成都埃法生物科技有限公司；Tween 80、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），上海麥克林生化科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒，沈陽萬類生物科技股份有限公司。

清潔級BALB/c 雄性小鼠（18 ～22 g），購自湖南斯萊克景達實驗動物公司，許可證號：SYXK（湘）2019-0004。實驗前放置在動物房適應性飼養7 d。

1.2 方法

將小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為空白組（生理鹽水組）、抑郁組（生理鹽水）、低劑量組（TD-CHR，大黃酚給藥量0.1 mg/kg）、中劑量組（TZ-CHR，大黃酚給藥量1.0 mg/kg）和高劑量組（TG-CHR，大黃酚給藥量10.0 mg/kg）。

1.2.1 構建CUMS 抑郁模型小鼠

參照文獻[9-10]的方法并進行適當的改進，刺激因素：41 ℃熱水游泳5 min、4 ℃冰水游泳5 min、夾尾2 min、籠子傾斜45°（8 h）、潮濕環境（12 h）、禁水24 h、禁食24 h、徹夜光照及振蕩。除空白組外其余每組每天隨機進行1 ～2 種刺激，保證不連續出現同種刺激，連續進行42 d。

每種刺激方法的具體操作如下：（1）熱水游泳，將小鼠放入裝有41 ℃熱水的塑料箱中，水深15 cm；（2）冰水游泳，將小鼠放入裝有冰塊的4 ℃冰水的塑料箱中，水深15 cm；（3）夾尾，用燕尾夾夾住距小鼠尾根部1 cm 處，每次同時夾四只同組小鼠；（4）籠子傾斜，將鼠籠靠墻以45°放置8 h；（5）潮濕環境，在鼠籠中導入100 mL 清水使墊料濕透，12 h 后再替換干凈墊料；（6）禁食，暫停供給飼料24 h；（7）禁水，暫停供水24 h；（8）徹夜光照，將小鼠放置在白熾燈照射的明亮房間中，持續24 h；（9）振蕩，將小鼠置于籠中，手動振蕩1 min。

1.2.2 動物模型評價指標和方法

（1）小鼠的體質量測量

在CUMS 造模前1 d（第0 天）、開始造模后第21天和第42 天對所有小鼠稱量一次體重。

（2）小鼠的糖水偏好測試

測定前1 天對小鼠進行一次糖水訓練（每只鼠籠放置1 瓶1%蔗糖水和1 瓶普通自來水，適應24 h）。于實驗第1 天、第21 天以及第42 天測定小鼠的糖水偏好度。測試開始先禁食禁水24 h，然后隨機在鼠籠放入1 瓶1%的蔗糖水和1 瓶普通飲用水，12 h 后，記錄瓶內液體的消耗量，按照公式（1）計算糖水消耗百分比。

式中：V糖和V水分別為1%蔗糖水消耗量和普通飲用水消耗量，mL。

（3）小鼠氧化應激指標的檢測

在完成行為學實驗后（即第42 天），將小鼠麻醉，取眼眶血后采用脫頸椎法處死小鼠，在冰上剝離全腦，取海馬組織，放入EP管中，在-80 ℃冰箱凍存以備取用。檢測時稱取一定數量海馬組織，置于玻璃勻漿器中，加入PBS 緩沖液，制備10%的組織勻漿，取上清液，嚴格按試劑盒說明書測定小鼠海馬MDA 和SOD 水平。

1.2.3 給藥方法

所有藥物通過腹腔注射，以10 g 體質量給藥0.1 mL 每天注射1 次，共42 d。

1.3 統計處理

應用SPSS 25.0 統計軟件，計量資料以均值±標準差表示，多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 大黃酚對CUMS 抑郁模型小鼠行為學的影響

圖1（a）顯示，給藥第21 天抑郁組的體重顯著低于空白組（P＜0.05），提示慢性不可預計刺激對小鼠的體重有影響；給藥第42 天后，抑郁組體重明顯低于CHR 劑量組（P＜0.05），且CHR 對體重的影響存在劑量依賴性。圖1（b）顯示，抑郁組小鼠糖水消耗百分比持續降低，與抑郁組相比，在實驗第21 天和42 天后空白組和各CHR 劑量組糖水消耗量升高（P＜0.05）。

圖1 CHR 對CUMS 小鼠行為學的影響（n=8）

應用CUMS 建立小鼠抑郁模型是當前運用最廣泛的方法，此方法主要是對動物進行長期輕度應激刺激以模擬人類在生活遇到的壓力和打擊，導致動物心理上的抑郁[11-12]。本實驗通過42 d 一系列的不可預知溫和隨機刺激建立抑郁動物模型，實驗中抑郁組體重增長緩慢，糖水偏好百分比顯著下降，表明小鼠心境低落、快感缺失，這些都是抑郁癥患者的核心癥狀之一，提示小鼠抑郁模型建立成功[13-14]。小鼠行為學的評估是評價藥物抗抑郁效果的重要指標，適量CHR的治療可顯著改善CUMS 抑郁模型小鼠的抑郁行為，表明CHR 對改善小鼠抑郁行為具有一定作用。

2.2 大黃酚對CUMS 抑郁模型小鼠海馬體中MDA及SOD 水平的影響

圖2（a）顯示，與空白組相比，抑郁組及大黃酚低、中、高劑量組中小鼠海馬體中SOD 活力顯著降低（P＜0.05）；與抑郁組相比，大黃酚中、高劑量組小鼠海馬體中SOD 活力顯著升高（P＜0.05）。圖2（b）顯示，與空白組相比，抑郁組及大黃酚低、中劑量組小鼠海馬中MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；與抑郁組相比，大黃酚高劑量組小鼠海馬中MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。

圖2 CHR 處理對CUMS 小鼠腦組織SOD 活力和MDA 含量的影響（n=8）

抑郁癥的發生與神經系統的氧化應激失衡關系緊密[15]。氧化應激失衡產生的過量氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）能作用于中樞神經系統，造成神經細胞RNA、DNA 斷裂以及脂質的損傷，從而誘導神經細胞凋亡，并影響其信息傳遞、細胞修復等功能[16-18]。表明抑郁癥患者認知功能受損的重要原因之一可能是氧化應激系統的激活。人體內抗氧化酶以超氧化物歧化酶（SOD）為主，其功能受到影響，會造成自由基大量堆積[19]。MDA 是脂質過氧化的重要代謝產物，其能衡量氧化應激的損傷程度[20]。研究表明，當發生氧化應激時，MDA 水平顯著升高，SOD水平顯著降低[21]?；诖?，本實驗用小鼠腦中海馬體SOD 活力和MDA 含量變化來揭示大黃酚可能的作用機制。實驗結果顯示，患有抑郁障礙小鼠大腦中的氧化應激系統存在顯著的失衡現象。給予大黃酚干預后，大腦組織中SOD 活力升高、MDA 水平降低，表明大黃酚能有效改善小鼠氧化應激系統，有助于小鼠認知功能恢復。

3 結論

綜上，大黃酚能改善CUMS模型小鼠的抑郁行為，其機制可能與改善小鼠海馬體的氧化應激系統平衡狀態有關。