胎盤體外模型的研究進展*

劉佳樂,漆洪波,張 華,陳 昶**

(1.重慶醫科大學生命科學研究院,重慶 400016;2.重慶醫科大學附屬婦女兒童醫院,重慶 400013;3.重慶醫科大學附屬第一醫院產科,重慶 400016)

胎盤位于母體和胎兒血管床之間,是妊娠期間胚胎、胚膜和母體子宮內膜聯合長成的母子間組織結合器官。胎盤對于維持胎兒的生命至關重要,其主要功能是進行母胎之間的物質交換和支持胎兒的生長發育[1]。胎盤發育障礙和功能缺陷與多種妊娠并發癥相關,包括先兆子癇、早產、不明原因死產和胎兒宮內生長受限。因此,對于胎盤的研究可幫助了解相關妊娠并發癥的發病機制,為臨床診療提供幫助。

闡明胎盤的發育和功能具有重要意義,但由于倫理問題和不同物種間胎盤解剖和發育的巨大差異,動物模型僅能提供有限的關于人類胎盤的信息[2]。為了更詳細地研究人類胎盤的發育和功能,研究人員開發了多種體外模型,包括體外人胎盤小葉灌注模型以及近期開發的胎盤芯片、滋養層干細胞和類器官培養模型。本綜述簡要描述人類胎盤生物學,以及介紹以上3種模型的研究進展。

1 人類胎盤生物學

人卵子和精子結合形成受精卵,到達子宮后轉化為囊胚,定植于子宮內膜,胎盤的發育由此開始。植入前的囊胚分化成內細胞團和滋養外胚層,囊胚在植入子宮內表面上皮5～6d后,滋養外胚層迅速增殖并分化為細胞滋養層(cytotrophoblast,CT),隨后CT分化為合胞體滋養層(syncytiotrophoblast,SCT)和絨毛外滋養層(extravillous trophoblast,EVT)。SCT是由CT融合形成的覆蓋在胎盤絨毛上的多核細胞,是母胎之間進行氣體、營養交換和產生激素的主要場所。CT侵入子宮內膜,形成EVT。EVT的作用是將胎盤固定在子宮上,并向子宮內膜深部浸潤,形成細胞柱,使子宮螺旋動脈重塑以增加血流量[3]。除滋養層細胞外,胎盤內還有滋養層巨細胞、霍夫鮑爾細胞、胎兒內皮細胞和蛻膜細胞等細胞,這些細胞對于胎盤的發育和功能也有重要意義[1]。

2 體外人胎盤小葉灌注模型

人胎盤小葉灌注模型是研究胎盤物質轉運的重要工具。通常取產后的胎盤作為模型基礎,不會對母體和胎兒產生傷害。Panigel等[4]于1967年首次描述了體外人胎盤小葉灌注模型,1972年由Schneider等[5]建立了體外人胎盤小葉雙重灌注模型。該模型經過發展變化,可適用于包括藥代動力學、納米顆粒轉移、血管張力調節、分泌功能、病毒感染等方向的研究。模型通過灌流管連接同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈建立胎兒側循環,另一灌流管插入螺旋動脈殘端建立母體側循環,模式圖見圖1。Hutson等[6]指出,體外人胎盤小葉雙重灌注模型是預測妊娠后期胎盤藥物轉運的有效方法。近期有研究將灌注模型與數學建模結合,提高對胎盤功能的理解[7]。離體胎盤灌注模型也存在一些缺陷[7]:(1)建立在妊娠晚期的成熟胎盤上,無法用于妊娠早、中期胎盤轉運的研究。(2)建立過程復雜,成功率較低(15%～20%)。(3)模型難以長時間維持胎盤組織的活性。在大多數研究中,胎盤灌注時間只有2～6h,僅有部分能達到48h,無法研究藥物的慢性暴露。

3 胎盤芯片

Lee團隊在2015年提出了胎盤芯片(Placenta-on-a-Chip)的方法,將微流控和微加工技術與胎盤滋養層絨毛膜癌細胞系培養相結合,用于模擬胎盤屏障的生理結構[8]。這種微器件由兩個聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)微流體通道組成,利用薄細胞外基質(extracellular matrix,ECM)膜隔開人滋養層細胞(human trophoblastic cell lines JEG-3,JEG-3)和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并進行分區灌注共培養,模式圖見圖2。該研究通過分析葡萄糖在模型上的轉運驗證其轉運功能,結果與先前報道的體內研究結果一致。微流體系統能模擬胎盤屏障血流動力學微環境,而且該模型的雙層結構比傳統細胞培養的2D平面結構更接近胎盤屏障的生理結構。研究人員利用該法研究了納米顆粒和咖啡因等物質的轉運。2021年Pu等應用3D微流體胎盤芯片模型建立胎盤侵襲微環境,模擬滋養層細胞與內皮細胞在滋養層微環境中的相互作用,并應用于毒理學測試[9]。2022年Mosavati等[10]在胎盤瘧疾和葡萄糖轉運研究中提到胎盤芯片模型中單向血流的局限性:子宮動脈血流是雙向的,應在適當剪切應力下通過搖擺運動使模型變為雙向流動,以模擬胎盤血液流動分叉。Richardson等[11]建立了三培養胎盤芯片模型,用3個PDMS微流控培養室分別培養SCT(毛喉素誘導BeWo融合形成)、CT(BeWo)和HUVEC,模擬胎盤滋養層-內皮層雙層結構;測試了普伐他汀和瑞舒伐他汀在模型上的擴散、代謝和效能,驗證了模型在研究胎盤藥代動力學方面的實用性。2022年6月,Deng等[12]建立了誘導人多能干細胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生滋養層干細胞(human Trophoblast stem cell,hTSC)方法與胎盤芯片結合的模型。該模型為微流體系統和ECM組成的3D培養室,允許hPSC衍生的hTSC分化為包含CT、SCT和EVT的滋養層樣組織。對動態環境培養的滋養層細胞的分析結果表明,剪切應力能促進hPSC衍生的hTSC分化為滋養層細胞。但與原代滋養層相比,該模型的滋養層樣組織的成熟度和功能還有一定差異。此外,培養條件還需進一步驗證。這是首個胎盤芯片與誘導hPSC衍生hTSC結合的模型,未來可能成為一種有力的胎盤研究工具。

圖2 胎盤芯片模式圖

Pemathilaka等[13]研究表明,胎盤芯片是非常實用的體外模型,可模擬胎盤動態生理環境,成本較低。Pemathilaka對胎盤芯片目前存在的挑戰進行了總結:(1)研究人員近幾年專注于模型的制造過程,僅對部分藥物的轉運進行了研究,目前還缺乏胎盤生理特性方面的研究;(2)模型需要復雜的驗證測試和質量控制;(3)模型所需的PDMS無法大規模制造。此外,PDMS對疏水性小分子的吸附能力,可能影響模型在藥物測試領域的應用。研究認為,用水凝膠替代PDMS可提升裝置的軟機械性能[14]。胎盤芯片可精準控制胎盤物質交換的各種關鍵參數,但需要耐心和細致的細胞培養,防止細胞污染影響研究結果。胎盤芯片模型剛剛起步,雖然還存在一些技術上的挑戰,但這種應用微工程技術解決問題的方法正在成為一種新的趨勢。

4 滋養層干細胞和類器官培養

胎盤滋養層細胞對于人類胎盤發育和功能的研究至關重要,但之前的滋養層細胞培養模型主要使用原代細胞和永生化細胞系。原代滋養層細胞難以分離純化,通常壽命有限且易發生表型變化;永生化細胞系則來源于絨毛膜癌(如Bewo、JAR和JEG-3等),雖然相對穩定且易于獲取,但與原代滋養層細胞存在差異[2]。2018年,研究人員開發了2D結構的滋養層干細胞培養模型[15]和3D結構的人滋養層類器官模型[2],在胎盤滋養層體外模型研究領域實現了重大突破。

4.1 滋養層干細胞培養 小鼠滋養層干細胞來源于囊胚和植入后的胚胎外胚層,是分析小鼠滋養層細胞分子生物學的最佳體外模型。2018年Okae等從人CT和囊胚中分離出了hTSC細胞,建立了人胎盤滋養層干細胞培養模型,為研究人類滋養層的發育和功能提供了重要工具[15]。

對原代滋養層的轉錄組進行分析,發現上皮干細胞增殖所必需的Wnt和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)信號通路相關基因在原代CT中表達最高,研究數據預測CT可能在其他上皮干細胞的培養條件下保持增殖?；谵D錄組分析結果,研究測試了各種可增強干細胞增殖的細胞因子,發現含有CHIR99021、EGF、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制劑、VPA和Y27632的培養基能實現CT細胞的長期培養。后續又對hTSC向EVT和SCT分化進行了研究,發現除了含CHIR99021的基礎培養基外,hTSC向EVT分化還需要NRG1、A83-01和基質膠Matrigel。向SCT分化則需aAMP激動劑forskolin和EGF。培養出的增殖性CT具有分化為SCT和EVT的能力,因此被定義為CT來源的hTSC。該研究從妊娠早期胎盤中獲得了hTSC細胞,并能持續增殖至少5個月,但無法從足月胎盤中獲得此類細胞。該研究培養的hTSC和分化細胞的轉錄組、甲基組具有許多滋養層細胞特征[16],并且與原代滋養層細胞高度相似。將hTSC植入非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)-重癥聯合免疫缺陷(severe combined immune deficiency mice,SCID)小鼠,發現可模仿滋養層侵入過程。最近有研究實現了從足月胎盤中獲得hTSC[17],該研究表明ΔNp63α與GCM1之間存在拮抗作用,發現缺氧和使用EGF/CASVY上調ΔNp63α活性抑制GCM1表達,可促進CT轉化為hTSC。

近期出現了另一種獲得hTSC的方法:誘導人多能干細胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生hTSC。hPSC包括人胚胎干細胞(human embryonic stem cell,hESC)和人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC),hiPSC由成纖維細胞等體細胞通過轉錄因子介導的重編程產生[18]。Castel等[18]研究中描述了將人體細胞重編程為hiPSC再衍生hTSC的路線圖。數個研究已實現了從幼稚hPSC誘導產生hTSC,而有爭議的是從始發態hPSC誘導hTSC過程中需要使用骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)處理,但這可能導致羊膜標志物活化,使誘導產生的細胞更接近羊膜譜系[19]。研究發現,C19MC miRNA表達對hTSC干性的維持非常重要,但始發態hPSC衍生的hTSC并不表達大多數C19MC miRNA[20],并且在始發態hPSC衍生的hTSC中重新激活C19MC miRNA的表達,也無法恢復其增殖和分化潛力。Jang等[21]研究表明,經短期BMP4處理的始發態hPSC可誘導為hTSC,與真正的hTSC具有相似的表達譜,并且在長期培養中具有自我更新和分化能力。Cui等[22]研究中,實現了誘導始發態hPSC在3D ECM培養下形成滋養層樣組織,并發現了生理微環境對滋養層分化的重要性。Wei等[23]報道了BMP4顯著增強從始發態hPSC誘導生成hTSC這一過程,以及敲除H3K27甲基轉移酶(EZH1/2)可提高誘導效率。在上文關于胎盤芯片模型的介紹中,提到了滋養層干細胞與芯片模型結合,用于研究動態環境對hPSC誘導為hTSC的影響[12]。

hTSC表達多種轉運蛋白,這表明它們可作為研究胎盤轉運和代謝活性的模型[23]。但是滋養層干細胞模型無法模擬滋養層細胞的3D組織結構,于是研究人員開發了下述的3D滋養層類器官模型。

4.2 滋養層類器官 與干細胞培養模型相比,類器官在解剖和功能上更接近活體的器官。Haider等[24]從純化的妊娠早期胎盤滋養層細胞中,建立了可自我更新的3D滋養層類器官。研究人員從妊娠6～7周的胎盤中分離純化出CT細胞,在特定條件下進行培養,幾天內便形成小細胞團,并在2～3周內迅速增殖發育成不規則的器官樣物質。類器官大約每14d傳代1次,并且可連續傳代超過5個月。培養條件包括抑制TGF-β和BMP信號傳導的A83-01和Noggin、EGF,激活Wnt信號的R-spondin,糖原合成酶激酶3α和3β(GSK-3α/β)抑制劑CHIR99021,以及前列腺素E2。該研究對培養物進行了分析,表明類器官細胞與人原代CT細胞的特性、干性、增殖標志物以及基因表達高度相似。

Turco等[2]開發了用于研究胎盤形成過程中母胎相互作用的滋養層類器官模型。該模型比Haider等[24]的模型更完善,培養物可長期增殖,遺傳穩定且具有定向分化能力。Turco等研究了妊娠6～8周時滋養層的信號通路,設計出由EGF、FGF2、CHIR99021、A83-01和Rspondin-1組成的基礎滋養層有機介質(TOM),后續又向TOM中添加了HGF、PGE2和Y-27632,發現CT在該培養條件下能在第二次傳代后(10～14d內)形成均勻的滋養層類器官。研究發現EGF對于CT的增殖最重要,其次是Y-27632、A83-01和CHIR99021。該研究描述了SCT融合和人滋養層類器官形成過程,并且證明了該類器官在解剖和功能上與體內胎盤非常相似,還討論了HLA-G+EVT的分化與侵襲作用。2020年,在Turco的方法基礎上,Sheridan等[25]對其進行了改進,并討論了與之前方法的區別。該研究在TOM中添加FGF2和Y-27632并去除Noggin,可增強細胞的增殖和存活率,EVT分化改為hTSC模型研究中的方法[15]。該培養方法傳代時間更短,僅需7～10d,且能連續傳代一年以上。

近兩年滋養層類器官逐漸開始應用于胎盤研究領域。Xu等設計了基于人滋養層類器官的高通量免疫熒光篩選方法,篩選和鑒定常用有機磷酸鹽阻燃劑(organophosphorus flame retardants,OPFRs)中破壞胎盤的化學物質[26]。Kreis使用滋養層類器官模型研究了細胞周期調節因子p21及其基因家族中的p27和p57在胎盤發育和子癇前期發病中的作用[27]。Sheridan等[25]表明,滋養層類器官不僅可用于研究滋養層的發育和功能,還可用于胎盤產物的分析。Sheridan等研究中提到了滋養層類器官的局限性:目前無法從足月胎盤中獲得滋養層類器官,而且類器官中沒有基質、內皮和骨髓來源的胎盤細胞。

目前已經有將干細胞和類器官兩種方法結合的模型——干細胞衍生的類器官模型[28]。最新研究發現,幼稚hPSC來源的hTSC也能形成滋養層類器官[29],這種類器官具有與之前滋養層類器官相當的組織結構、胎盤激素分泌和長期自我更新的能力。該研究證明了類器官中多種細胞的滋養層身份和分化能力,表征了從幼稚hiPSC到建立類器官過程中的X染色體失活動力學,并用該模型探討了胎盤發育和對不同病原體的易感性。滋養層干細胞和類器官模型培養的細胞與原代滋養層細胞的表達譜差異較小,細胞合成分泌功能接近,未來可作為研究胎盤合成分泌功能的理想模型。滋養層干細胞和類器官細胞培養模式圖見圖3。

圖3 滋養層干細胞和類器官培養過程示意圖

5 討 論

體外人胎盤小葉灌注模型在胎盤屏障功能、物質轉運和胎兒藥物暴露等研究方向有成熟的應用。其最大的優勢是擁有完整的人類胎盤結構,在解剖學上最接近生理狀態。但其缺點在于無法用于胎盤早、中期的研究,且操作復雜,難以開展標準化、規?；芯?。胎盤芯片能模擬胎盤的部分多層結構和屏障功能,且可提供其他細胞培養模型缺少的胎盤動態環境,實驗程序相對簡易且重復性良好,更適合用于孕早、中期胎盤的屏障和轉運功能研究(如高通量藥物轉運研究),但不太適用于研究胎盤的發育過程和分泌功能。相反,滋養層干細胞和類器官的生理特性更接近原代滋養層細胞,更適用于研究胎盤的發育過程和分泌功能,但由于其結構難以區分母體面和胎兒面,因此暫不適用于研究胎盤的屏障和轉運功能。

本文介紹了三種胎盤體外模型的發展和應用,以及目前存在的局限性。綜上所述,三種模型各有優缺點,在應用領域方面形成互補,可根據具體研究目的選擇合適的胎盤體外模型。隨著分子生物學和生物工程等技術的快速發展,胎盤體外模型將不斷創新和優化,為該領域的研究帶來廣闊前景。