皮質發育不良相關藥物難治性癲癇患者的血漿微小RNA 表達譜

孫宇強 李慶偉 張遠洋 閆曉楓 榮維娜 宋新宇 程化坤

作者單位：150036 黑龍江哈爾濱，黑龍江省醫院神經外科（孫宇強、李慶偉、張遠洋、榮維娜、宋新宇、程化坤），檢驗科（閆曉楓）

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，嚴重危害患者的健康，對社會和患者家庭都造成極大的經濟負擔。我國有近千萬的癲癇患者，很多患者由于家庭經濟條件較差，無法進行正規的治療，最終發展為藥物難治性癲癇［1］。難治性癲癇的危害很大，反復抽搐發作造成的神經系統損傷不斷累積，不但加重了患者病情，更極大地延誤了后續治療（尤其是外科治療）的時機［2］。盡管目前腦皮層電圖已廣泛應用于臨床，但對癲癇的診斷仍然依賴于患者的病史詢問。目前認為皮質發育不良（focal cortical dysplasia，FCD）可能是難治性癲癇的重要病因，關于難治性癲癇的診斷，目前尚沒有明確統一的標準［3-4］。因此急待尋找能對難治性癲癇進行早期、準確、有效、安全、快速診斷的評估手段，從而在整體上改善難治性癲癇的預后，具有臨床意義。

微小RNA（micro RNA，miRNA）是一類自然生成的核苷酸小RNA 分子，具有較高的組織特異性。miRNA 在人類疾病的分子診斷中擁有巨大的潛能，尤其是一些缺乏客觀監測指標的疾病，通過對簡單易得的體液（如血漿、腦脊液等）進行檢測，如果能夠發現某個或者某類miRNA 在難治性癲癇患者中表達明顯改變，且對疾病診斷具有明確的指導意義，就能建立一種客觀、準確的標準來對癲癇患者進行診斷與治療［5-6］。有研究表明，臨床上難治性癲癇最主要的病理改變是局灶性FCD［7］。有研究證實，miR-129-2-3p 在FCD 相關難治性癲癇動物模型中的表達水平明顯升高［8］。目前多數研究均采用動物模型來探討miRNA 與癲癇的關系，而采用基因芯片方法探討癲癇患者中藥物難治性癲癇與miRNA關系的研究較少。本研究通過分析FCD 相關藥物難治性癲癇患者的血漿miRNA 表達譜，旨在為臨床診斷靶點的探索提供數據支持，現報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象及臨床資料 采用隨機對照研究方法，從遼寧省癲癇疾病診療中心術后切除的大腦致癇灶皮質標本中挑選出9 份經病理檢查證實符合FCD 的樣本，同時選取8 份正常腦組織樣本作為對照皮質。另選同期在黑龍江省醫院手術治療的60 例FCD 相關藥物難治性癲癇患者作為研究對象，分別采集手術切除的致癇灶腦皮質組織及患者血漿作為檢測標本。其中男性32 例，女性28 例；年齡21～48 歲，平均（35.64±1.29）歲；病程3～12 年，平均（7.24±1.23）年；病程≥5 年41 例，＜5 年19 例；發作頻率1～12 次/月，平均（6.24±0.32）次/月，發作頻率≥4 次/月36 例，＜4 次/月24 例；預后良好43 例，預后不良17 例。

1.1.1納入標準 ① 均符合FCD 相關藥物難治性癲癇的診斷標準；② 年齡≥20 歲；③ 患者及家屬對本研究已知情同意，并已簽署同意書。

1.1.2排除標準 ① 合并其他神經系統性疾病者；② 合并惡性腫瘤患者；③ 合并血液系統疾病患者；④ 病歷資料數據缺失者。

1.1.3倫理學 本研究符合醫學倫理學標準，并經本院倫理委員會審批（審批號：SYYLLBA202132）。

1.2研究方法 采用Affymetrix 4.0 miRNA 基因芯片（北京博奧晶典生物技術有限公司）對兩組腦組織標本篩選出差異miRNA 表達譜。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR），采用7500 實時熒光定量PCR 儀（美國賽默飛公司）考察miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在FCD 相關致癇灶腦皮質組織及患者血漿中的表達量，qRT-PCR 試劑盒購自北京天根公司。檢測時先采集致癇灶腦皮質組織標本2 g 及患者血漿標本4 mL，分別提取總RNA，采用反轉錄試劑盒（購自北京天根公司）先將待測標本反轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），而后實施qRT-PCR 檢測。反應體系為20 μL，其中即用型預混液8.0 μL，cDNA 4.0 μL，上/下游引物分別為0.8 μL，添加無RNA酶水6.4 μL。相關反應條件為：95 ℃ 5 min，相同溫度下30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 個循環。miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 引物序列均由北京博奧晶典生物技術有限公司設計制作。測定結果通過2-△△Ct法計算各指標的相對表達量。

1.3觀察指標 ① 比較兩組腦組織中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 的相對表達量；② 比較FCD 相關難治性癲癇患者腦組織和血漿中的miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 的相對表達量；③ 比較不同病程、發作頻率、預后患者血漿中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表達量；④ 分析血漿中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 對FCD 相關藥物難治性癲癇的診斷價值。

1.4統計學方法 采用SPSS 24.0 統計軟件分析數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）并計算ROC 曲線下面積（area under ROC curve，AUC）分析血漿中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p對FCD相關藥物難治性癲癇的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1FCD 腦組織和正常腦組織樣本中的miRNA 相對表達量比較 FCD 腦組織中的miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的相對表達量均明顯高于對照皮質（均P＜0.05）。見表1。

2.2FCD 相關難治性癲癇患者腦組織和血漿中的miRNA 相對表達量比較 FCD 相關難治性癲癇患者血漿中的miRNA-129-2-3p 相對表達量較腦組織中均明顯更高（均P＜0.05）。miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p、miRNA-485-3p 在FCD 相關難治性癲癇患者血漿及腦組織中的表達量比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3不同病程、發作頻率以及預后FCD 相關難治性癲癇患者血漿中miRNA 的表達量比較 病程≥5 年、發作頻率≥4 次以及預后不良患者血漿中的miRNA-129-2-3p 表達水平均明顯高于病程＜5 年、發作頻率＜4 次以及預后良好患者（均P＜0.05）。不同病程、發作頻率以及預后患者血漿中miRNA-935、miRNA-4521、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表達量比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖1～3。

圖1 不同病程患者血漿中miRNA 的表達量比較

圖2 不同發作頻率患者血漿中miRNA 的表達量比較

圖3 不同預后患者血漿中miRNA 的表達量比較

2.4FCD 相關藥物難治性癲癇患者血漿中miRNA表達量對疾病的診斷價值 ROC 曲線分析結果顯示，血漿中miRNA-129-2-3p 對FCD 相關藥物難治性癲癇的診斷價值最高，AUC 為0.894，95%可信區間（95% confidence interval，95%CI）為0379～0.974，敏感度為93.66%。見表3。

表3 血漿中miRNA 表達量對FCD 相關藥物難治性癲癇的診斷價值

3 討論

癲癇作為一種臨床十分常見的神經系統疾病，通常是由于患者的腦神經發生異常性過度放電或同步化活動而引起的相關病癥。臨床有研究顯示，癲癇患者在初始發病時的年齡往往較小，且可能會長期反復發作，從而嚴重危害患者的身心健康［9-11］。一般認為，癲癇的發病時長大于20 min 則可能會導致大腦皮層處于缺血缺氧狀態，而若時長大于1 h，則可能導致患者的腦組織發生不可逆的損傷，嚴重者甚至會直接導致全身性的器官功能衰竭或腦死亡等，危害較大［12-13］。

FCD 屬于一類腦皮質發育畸形狀態，在整體癲癇患者群體中占比為40%～50%［14-15］。既往臨床通常首選藥物治療癲癇，但部分患者易出現耐藥性，導致治療效果欠佳，手術療法對藥物難治性癲癇雖然具有一定療效，但依然存在少數患者的預后不佳，且術后仍會存在癲癇發作癥狀，較大地影響了患者的生存狀態［16-17］。因此，尋找一種科學、精準的生物標志物對FCD 相關藥物難治性癲癇患者的臨床診斷具有重要的應用價值。

本研究表明，FCD 腦組織中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 以及miRNA-485-3p 的相對表達量較對照組明顯更高，提示miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在FCD 腦組織中均呈現出高表達狀態。究其原因主要是由于上述檢測指標均為miRNA 的家族成員，且在癲癇發病進程中不同程度地參與了神經系統的炎癥應激反應和神經元壞死、神經細胞的凋亡和樹突生長以及突觸重塑和膠質細胞的增生等過程中，同時與癲癇網絡的產生和神經遞質及受體功能的損傷存在緊密關聯［18-19］。同時，本研究結果顯示，FCD 相關難治性癲癇患者血漿中miRNA-129-2-3p 的相對表達量較腦組織中明顯更高。miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在患者血漿及腦組織中的表達差異無統計學意義。這提示了血漿中miRNA-129-2-3p 的高表達可能對FCD 相關難治性癲癇患者具有較好的診斷效果，且診斷價值較腦組織更高。miRNA-129 主要是通過miR-129-1 及miRNA-129-2 這兩個基因轉錄而形成，其中前者主要位于人體的7 號染色體，而后者主要位于11 號染色體的雙核苷酸CpG 島上［20］。miRNA-129-3p 是經前體3'端處理后產生的成熟型miRNA，而miRNA-129-2前體經過剪切加工后最終形成成熟的miRNA-129-2-3p。miRNA-129-1 前體則可加工產生成熟型miR-129-5p。馬雪蓮等［21］研究指出，miRNA-129-5p 的高表達能夠有效緩解阿爾茲海默癥模型大鼠的神經損傷以及炎癥反應，且miRNA-129-5p/SOX6信號通路可能有助于臨床治療。因此，miRNA-129-2-3p 可能亦是通過某種信號通路而影響FCD 相關難治性癲癇的發病進程，這也值得后續深入探索。事實上，由于腦組織標本的提取過程比較困難，血漿miRNA-129-2-3p 若能實現更佳的診斷價值，則有可能更有助于在臨床診治過程中的應用和推廣。

本研究結果顯示，病程≥5 年、發作頻率≥4 次以及預后不良患者血漿中miRNA-129-2-3p 的表達水平分別較病程＜5 年、發作頻率＜4 次以及預后良好患者明顯升高。不同病程、發作頻率以及預后患者血漿中miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表達比較差異均無統計學意義。進一步根據ROC 曲線分析表明，血漿中miRNA-129-2-3p 對FCD 相關藥物難治性癲癇的診斷價值最高，其中AUC 為0.894，敏感度為93.66%。上述結果再次表明了血漿中miRNA-129-2-3p 對FCD 相關藥物難治性癲癇的病情及預后均具有較高的診斷價值，可以用于臨床對該疾病的有效監測［22-23］。

綜上所述，FCD腦組織中miRNA 呈高表達，血漿中的miRNA-129-2-3p 高表達可能對FCD 相關難治性癲癇患者具有較高的診斷價值，值得關注。

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