基于網絡藥理學探究葛根芩連湯異病同治的機制研究

王 鑫 劉旭妍 蔣廣祥 侯來永 尹 玨※ 鄭 爽

異病同治是傳統的中醫理論,即不同的疾病出現相同的病因病機可采用相同的治療方法。在西醫知識體系中往往是專病專治,很少使用異病同治的治療思路。潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、2型糖尿病等都有特定的西醫治療方案,但是在中醫治療可以采用相同的治療方法,達到治療不同疾病的目的。

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因及發病機制復雜的炎癥性腸道疾病。中醫治療UC可緩解癥狀,且預防復發有較好的臨床療效。Fan Y、洪順芳等[1,2]在臨床研究中發現應用葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎可進一步提高療效。腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種臨床常見病,可顯著影響患者生活質量。中醫學中,IBS屬于腹痛、泄瀉范疇,Li C Y[3]的研究發現中醫治療IBS療效確切,且效果優于單純的西藥治療。司徒淳羽、袁兵等[4,5]在臨床研究中應用葛根芩連湯治療IBS,發現治療組生活質量評分等明顯優于對照組。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)是一種代謝性疾病,以高血糖為主要特征。在2型糖尿病的中醫治療中多種處方均有不錯的效果,與西醫治療結合更容易得到患者的認可,有見效快、副作用小等多重優勢。Yuhang Ren等[6,7]在研究中發現,在西醫常規治療基礎上聯合葛根芩連湯治療2型糖尿病可顯著提高治療有效率。

葛根芩連湯源自張仲景《傷寒論》第34條:“太陽病,桂枝證……葛根黃芩黃連湯主之”[8]。該方由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成,屬清熱藥,可解表清里,主治身熱下利,胸脘煩熱,口感作渴,喘而汗出等證。劉蓮萱[9]等基于藥物成分和藥效關聯Q-maker研究發現葛根素、黃芩素、黃連堿等14個成分是葛根芩連湯的藥效物質基礎。池美華等[10,11]研究發現,葛根芩連湯被應用于消化系統和內分泌系統等多種疾病。因此,葛根芩連湯是異病同治的典型用藥,現有研究重點多在“葛根芩連湯治療2型糖尿病”上,對于其異病同治的原理與機制研究相對較少。

本研究旨在通過網絡藥理學研究葛根芩連湯異病同治的分子學基礎,為葛根芩連湯治療多種不同疾病提供理論支持,同時結合葛根芩連湯對多種疾病臨床研究的結果,總結葛根芩連湯的療效。

1.方法

1.1 獲取葛根芩連湯有效成分及靶點

運用中藥系統藥理數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)檢索葛根芩連湯中葛根、黃芩、黃連、甘草四味中藥的所有化學成分。篩選口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(drug-like,DL)≥0.18的化合物及其作用靶點。利用Uniport數據庫對TCMSP獲取的靶點進行標準化和統一。

1.2 獲取潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病和葛根芩連湯的共有靶點

通過GeneCard數據庫搜索3個疾病的相關靶點,篩選關聯度大于1的基因靶點。對藥物靶點與篩選后的疾病靶點取交集,得到潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病和葛根芩連湯的共有靶點。

1.3 網絡構建

以“1.1”和“1.2”得到的有效成分、共有靶點、藥物為節點,導入CytoScape3.8.1軟件中構建“葛根芩連湯-有效成分-共有靶點”相互作用網絡模型。

1.4 蛋白質相互作用網絡

將“1.2”中得到的共有靶點輸入至String網站構建并繪制蛋白質相互作用關系圖(PPI),設置confidence score值為0.900,將PPI網絡以TSV格式導入CytoScape3.8.1軟件中進行可視化處理。

1.5 生物學功能及通路富集分析

用Metascape數據庫對共有基因進行基因本體分析(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)。

1.6 篩選通路的關鍵靶標

將關鍵通路靶點分別導入String 11.0數據庫。用Cytoscape3.6.0軟件進行Network Analysis網絡拓撲分析,根據度值(Degree)篩選出關鍵靶標。

2.結果

2.1 葛根芩連湯中有效成分篩選及靶點的獲取

將葛根芩連湯中葛根、黃芩、黃連、甘草4味中藥上傳至TCMSP數據庫,按照OB≥30%,且DL≥0.18的篩選標準,葛根芩連湯中有146個活性化合物,去重后共獲得242個藥物作用靶點。見表1。

表1 葛根芩連湯藥物作用靶點TOP50

2.2 葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征和2型糖尿病的共有靶點獲取

通過GeneCards數據庫搜集UC、IBS、T2DM 3種疾病的相關靶點,獲得UC靶點4852個,IBS靶點3166個,T2DM靶點8806個,篩選Relevance score≥1的靶點之后,UC靶點188個,IBS靶點1048個,T2DM靶點4500個。疾病靶點與葛根芩連湯的242個靶點取交集,最后得到共有靶點33個,并繪制Venn圖。見圖1,表2。

圖1 葛根芩連湯與UC、IBS、TDM交叉Veen圖

表2 葛根芩連湯與UC、IBS、TDM重合基因靶點

2.3 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM網絡圖

將“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件后,構建“中藥-有效成分-共有靶點”網絡圖。見圖2。

圖2 葛根芩連湯-有效成分-共有靶點網絡圖

2.4 對共有靶點進行分析

將33個共有靶點導入STRING數據庫,構建共有靶點的蛋白質相互作用關系網。以TSV格式導入Cytoscape軟件,用“Analyze Network”功能計算各靶點的度值(Degree),平均值為20.61,排在前4位的蛋白分別是AKT1(Degree=30),TNFRSF1A(Degree=23),HMOX1(Degree=23),MMP2(Degree=23)。見圖3。

圖3 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM共有靶點蛋白相互關系網絡圖

2.5 葛根芩連湯與UC、IBS及T2DM交集基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析

GO富集分析結果顯示,生物過程(Biological Process,BP)20個,主要涉及蛋白質磷酸化,炎癥反應細胞凋亡、細胞遷移等。見圖4。

圖4 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM的GO功能富集分析

2.5.2 KEGG分析

KEGG信號通路分析獲得P<0.01、最小計數為3且富集因子>1.5的通路16條,包括癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路等。見圖5。

圖5 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM的KEEG富集分析

3.討論

在臨床治療中,西醫通過對相關指標的收集對患者疾病進行診斷,進而按照相應的治療規范進行治療;區別于西醫,中醫更關注辨證論治。不同的疾病在發生發展過程中,可出現相同的病機,從而采取相同的治療方法,即異病同治。

在本研究中,我們同時對其分子機制進行探索,通過TCMSP的篩選及靶點預測,并與潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、糖尿病靶點進行映射,最終得到了33個有效靶點。有效靶點對應的活性成分排名前三的依次是槲皮素(quercetin)、異黃酮(formononetin)、山柰酚(kaempferol)。這三種成分均為黃酮類化合物,可能是葛根芩連湯發揮異病同治的主要成分。黃連、黃芩、甘草三味中藥中都包含槲皮素。槲皮素有多重生物活性,可發揮抗動脈粥樣硬化、抗癌及抗炎作用[12],可有效抑制結腸炎性損傷。槲皮素可抑制HMGB1和TLR4蛋白和基因的表達抗動脈粥樣硬化[13],可發揮降脂作用,調節膽固醇含量[14]。另一方面槲皮素可以降低甘油三酯的水平,提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等酶的活性[15]。Jeong SM等[16]的研究中發現槲皮素通過AGE-RAGE信號通路發揮作用,可以有效改善2型糖尿病的高糖高脂血癥。Sotniknova R[17]發現黃酮化合物有抗氧化特性,且槲皮素抗氧化能力強,其研究證明槲皮素衍生物可有效抑制結腸炎癥損傷。異黃酮與山茶酚分別存在于葛根和甘草中。異黃酮具有抗癌與抗心血管疾病的作用[18],可抑制NF-kB信號通路的激活,降低黏附分子mRNA的水平和蛋白表達量,從而發揮抗動脈粥樣硬化作用[19]。山柰酚有抗癌、降低血糖作用[20],可增強抑癌基因活性,誘導腫瘤細胞凋亡;Park M Y[21]認為山柰酚是一種有效的抗炎藥,對結腸黏膜有保護作用;同時山柰酚被認為是新一代用于2型糖尿病治療的胰島素增敏劑[22],可改善糖尿病內皮功能障礙,有效預防2型糖尿病并發癥的產生與發展。以上3種物質均屬于黃酮類化合物,有抗氧化和抗炎作用,可對UC和IBS起到治療作用,其中槲皮素與山柰酚可有效作用于T2DM。通過抗癌、抗動脈粥樣硬化及AGE-RAGE等作用進行干預,發揮異病同治作用。

對共有靶點進行拓撲分析并篩選出核心靶點12個,排名靠前的依次是血管內皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素-8(CXCL-8)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)。陳翠連等[23]在研究炎癥性腸病與心血管疾病的關系時發現炎癥反應在動脈粥樣硬化與潰瘍性結腸炎的發病機制中發揮著必不可少的作用,持續的炎癥反應會導致動脈粥樣硬化水平升高。同時VEGFA可促進新血管生成,與動脈粥樣硬化通路有著密不可分的關系。Zhen Y等[24]發現白細胞介素參與腸易激綜合征的病理過程,其中CXCL-8是IBS的重要促炎因子,可誘發和促進腸道黏膜炎性反應。CXCL-8還可介導IL-1、TNF-α等炎性因子的表達,炎性因子與腸道菌群相互作用,加快IBS病理進程。循環中CXCL-8水平的升高與T2DM有一定相關性,CXCL-8升高可以診斷炎癥狀態和代謝較差的患者[25]。AKT是胰島素信號通路下游的效應因子,可被胰島素、胰島素生長因子激活[26]。AKT分子上調,通過多種通路的聯合作用最終達到降糖的目的,改善胰島素抵抗。此外PI3K-AKT信號通路,參與促炎性因子的釋放[27],同時可激活NF-kB,介導腸道炎癥反應和黏膜損傷[28],當此通路過度活化時會誘導潰瘍性結腸炎癌變[29]。

綜上所述,葛根芩連湯治療疾病是通過動脈粥樣硬化、癌癥通路、AGE-RAGE通路發揮作用。VEGFA、CXCL-8及AKT1在發揮本身生化作用的同時,通過激活相關通路的其他靶點聯合作用起到相關作用,臨床治療效果十分顯著。本研究通過網絡藥理學對葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病的共同作用機制進行了探討,為異病同治提供了藥理機制層面的理論支持,為臨床應用提供了一定的科學依據,也為進一步的通路研究、機制研究的具體實驗提供了參考。本研究只是在分子層面進行預測,尚未進行相關實驗的驗證,仍需提供相關理論依據做出進一步驗證。