miRNA-21的循環放大檢測及成像

孫鑫鑫, 李家家, 丁彩鳳

(青島科技大學 化學與分子工程學院, 山東 青島 266042)

眾所周知,miRNA 是一類非編碼單鏈RNA,長度約為18～22 個核苷酸[1]。miRNA 的類型有很多,比如miRNA-21[1-2]、miRNA-30b[3]、miRNA-122[4]等。有很多研究報道,單個的miRNA 具有調節和抑制癌基因表達能力,miRNA 的部分缺失還會導致癌癥的發生[5]。因此,越來越多的學者對于miRNA 進行了相關的實驗研究與理論探討,期望通過對miRNA 的研究實現對人體癌癥的早起診斷與預防[6]。

納米材料碳量子點,在2004年被首次發現[7],它類似球形,其直徑小于10 nm,通常包括C、H、O、N 4種基本元素[8-9],其表面含有氨基、羧基、羥基等官能團[10]。CDs具有普通納米材料沒有的熒光性能,可以用于構建熒光探針。同時,CDs的毒性更低、親水性更好、光穩定性更好,使得CDs可用于細胞成像,且紅色發射的CDs使得具有更高的成像深度,具有一定的體內檢測優勢[11]。

聚多巴胺納米球(PDANSs)也是當前備受關注的新型仿生材料,主要是多巴胺 (DA) 在水溶液中通過自身的氧化-聚合形成的[12]。不僅可以用作生物相容的熒光傳感器和生物成像[13],而且還可以通過能量轉移或電子轉移過程對鄰近的熒光團產生顯著的熒光猝滅效應[14]。將多種多功能納米材料進行聯合使用,更有助于提高對腫瘤標志物的檢測效率,對于癌癥的早起診斷與預防具有深遠意義。

本研究通過合成兩種多功能納米材料,進而組裝成為納米探針,實現對腫瘤標志物miRNA-21的相關檢測及細胞成像。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高壓釜,FCF-0.5型,鄭州科達機械儀器設備有限公司;0.22μm 的微孔濾膜過濾器,河南泰斯特儀器有限公司;透射電子顯微鏡,JEM-F200 型,日本電子株式會社;掃描電子顯微鏡,Regulus 8100型,銳力科技股份有限公司;紫外可見分光光度計,UH5300型,日本日立高新技術公司;熒光分光光度計,F-4600型,日本日立高新技術公司;激光粒度分布儀,WT NanoZs型,英國馬爾文儀器有限公司。

檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2 H2O)、鹽酸多巴胺(C8H12Cl NO2)、無水乙醇(C2H6O)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、異丙醇(C3H8O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)。DNA、miRNA 及多肽具體序列見表1所示。新鮮菠菜購自本地超市。

表1 DNA、miRNA和多肽的序列信息Table 1 Sequence information of DNA,miRNA and polypeptide

1.2 實驗過程

1.2.1 紅色發射CDs的合成及表征

以新鮮菠菜葉為碳源,合成了具有紅色發射的CDs。取0.5 g去除莖脈的新鮮菠菜葉,加入5 m L 0.1 g·mL-1的檸檬酸鈉溶液,20 mL無水乙醇,水熱法150℃反應12 h后經0.22μm濾膜過濾,再經透析、純化、冷凍干燥一系列過程,最終得到固體CDs。

1.2.2 PDANSs的合成及表征

100 m L Tris緩沖液(10 mmol·L-1)和40 m L異丙醇的混合物中加入0.1 g鹽酸多巴胺,在黑暗中連續攪拌12 h,最終得到的溶液進行離心,水洗重復3次,最后對沉淀進行干燥后重新分散,之后進行PDANSs的SEM、TEM、FT-IR、紫外、Raman、抗污染等一系列表征。

1.2.3 納米探針的自組裝過程

等物質的量zyme鏈與sub鏈淬火(95℃加熱5 min,之后緩慢降至室溫)后與CDs及連接抗污染多肽的PDANSs進行混合,然后加入適量的DMAP(0.1 mmol·L-1)作為高效的?；磻呋瘎┯糜诎被c羧基的連接,靜止12 h后離心去除未連接的DNA zyme、CDs、PDANSs及偶聯劑。

1.2.4 miRNA-21的檢測與細胞成像

將自組裝的納米探針與靶標miRNA-21 及Mg2+體外反應一段時間后,分別測不同濃度、不同時間下的熒光強度變化,之后進行細胞成像。

1.3 實驗原理

體內外檢測過程原理見圖1,首先合成了CDs和PDANSs兩種納米材料,其中PDANSs既可以作為CDs的熒光猝滅劑,又可作為材料載體,保證納米復合材料可以順利進入到細胞中。同時表面連接的抗污染多肽,可以提高納米材料在檢測過程的抗污染效果,避免受到其他蛋白的干擾,影響實驗測定。CDs與PDANSs、DNA 通過酰胺鍵進行連接,此時CDs與TAMRA-N 的熒光通過熒光共振能量轉移分別被PDANSs及BHQ 2猝滅,并無熒光信號。在miRNA-21 存在的情況下,DNA sub 鏈與miRNA-21鏈進行配對的堿基數更多、結合力更強,可實現與miRNA-21 鏈的特異性結合,導致DNA sub-zyme鏈解離,實現CDs 650 nm 發射處的紅色熒光恢復。游離的DNA zyme鏈會在Mg2+存在的條件下實現對DNA sub 鏈的特異性切割,導致TAMRA-N 580 nm 處的橙色熒光恢復。之后DNA zyme鏈進一步進行游離,實現另外DNA sub鏈的切割,從而達到信號檢測的循環放大效果,提高檢測的靈敏度,而且雙熒光檢測可以提高檢測結果的準確性。

2 結果與討論

2.1 CDs的相關表征

2.1.1 CDs的形貌及拉曼表征

通過水熱法合成了具有紅色發射的CDs,并對其進行了形貌、粒徑、電位、官能團等一系列表征,見圖2～圖5。

圖2 CDs的TEM 照片Fig.2 TEM images of CDs

以菠菜葉、乙醇、檸檬酸鈉為原料,合成了CDs。圖2為CDs 在不同標尺下的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。由圖2可以看出,所制備的納米材料CDs為分散均勻的球形結構,粒徑在2～7 nm。插圖為CDs的高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)?？梢钥闯?所制備的CDs具有分辨率良好的晶格條紋,平面間距為0.23 nm。圖3為CDs的動態光散射水合半徑分布圖。結果顯示粒度分布主要集中在10 nm 左右的范圍內,相比較干燥后的樣品所進行的透射電鏡成像來說,水合粒徑因其表面電荷對溶液中H+、OH-的吸附,使得所測得的粒徑結果較透射電鏡顯示的粒子半徑大些。

圖3 CDs的DLS粒度表征Fig.3 Size distribution of CDs

然后對CDs的合成進行了拉曼光譜表征,以驗證CDs的成功制備見圖4。如圖4所示,在1 369,1 563 cm-1處顯示出了CDs的典型拉曼峰,其中1 369 cm-1屬于D 帶,歸因于無定形碳,表示C 原子的晶格缺陷,而1 563 cm-1屬于G 帶,歸因于石墨碳,表示C 原子sp2雜化的面內伸縮振動。圖4拉曼光譜顯示了CDs在D 帶與G 帶的典型拉曼峰,表明了所制備的CDs含有兩種類型的碳物種,證明了CDs的成功合成。

圖4 CDs的Raman光譜表征Fig.4 Raman images of CDs

2.1.2 CDs的紅外光譜表征

利用紅外光譜對CDs的化學組成和成鍵進行了進一步的表征,見圖5。

圖5 CDs的紅外光譜表征Fig.5 FT-IR spectrum of CDs

從圖5可以看出CDs的主要成鍵組成,其表面含有多種官能團。其中,在3 427 cm-1的吸收帶對應于N—H 的伸縮振動,2 975,2 925,2 865 和1 460 cm-1處比較寬的吸收帶歸因于CH、CH2、CH3的伸縮和彎曲振動,1 616 cm-1處比較尖銳的吸收帶被指定為的伸縮振動,而1 386,1 375 cm-1處的寬吸收帶及1 227 cm-1處的吸收帶歸因于C—N 的伸縮振動,1 080 cm-1處的吸收帶是由C—O—C 的伸縮振動引起的。以上的紅外數據表明,CDs表面含有大量的氨基,便于后面對納米材料進行表面修飾。

2.1.3 CDs的相對熒光量子產率測定

對于CDs的相對熒光量子產率進行了測定與計算,選擇以硫酸奎寧為標準,通過測定硫酸奎寧與CDs的熒光與紫外吸收,對CDs的相對熒光量子產率進行計算。硫酸奎寧的紫外吸收光譜和熒光光譜見圖6和圖7。CDs的紫外吸收光譜和CDs的熒光光譜見圖8和圖9。

圖6 硫酸奎寧的紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of quinine sulfate

圖7 硫酸奎寧的熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectrum of quinine sulfate

圖8 CDs的紫外吸收光譜Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum of CDs

圖9 CDs的熒光光譜Fig.9 Fluorescence spectrum of CDs

通過公式Yu=Ys×Fu/Fs×As/Au計算出,CDs紅色發射的相對熒光量子產率為13.3%。

2.2 PDANSs的相關表征

2.2.1 PDANSs的形貌表征

以鹽酸多巴胺為原料進行PDANSs的制備,然后對其進行了材料表征。

圖10 為PDANSs 的TEM 照片。圖11 為PDANSs的SEM 照片。由圖10、圖11兩圖可以看出,制備的PDANSs納米材料的粒徑在200 nm 左右。而圖12的動態光散射粒度分布直方圖的數據也可以更加直觀地說明,所制備的納米材料PDANSs的平均粒徑在200 nm 左右。

圖10 PDANSs的TEM 照片Fig.10 TEM image of PDANSs

圖11 PDANSs的SEM 照片Fig.11 SEM image of PDANSs

圖12 PDANSs的DLS粒徑表征Fig.12 Size distribution of PDANSs

2.2.2 PDANSs的紫外及熒光表征

根據本課題設計原理,需要PDANSs具有比較寬泛的紫外吸收,從而達到可以猝滅CDs熒光的效果。

圖13為PDANSs的紫外吸收光譜。

圖13 PDANSs的紫外吸收光譜Fig.13 UV-Vis absorption spectrum of PDANSs

由圖13 可以發現,PDANSs的紫外吸收光譜與所預想的相一致,具有比較寬的紫外吸收,可以實現對CDs 的熒光猝滅。不同濃度的PDANSs 對CDs的熒光猝滅效果見圖14?？梢钥闯?PDANSs對CDs的熒光猝滅效果比較明顯。

圖14 PDANSs對CDs的熒光猝滅效果Fig.14 Fluorescence quenching effect of PDANSs on CDs

2.2.3 PDANSs的拉曼及紅外光譜表征

通過拉曼及紅外光譜對PDANSs進行了表征,來驗證PDANSs的成功合成。

圖15為DA、PDANSs的拉曼光譜表征,與單體多巴胺相比較,PDANSs在1 400、1 550 cm-1處出現了明顯的拉曼特征峰,證明了PDANSs的成功合成。同時從(圖16)DA、PDANSs的紅外光譜可以看出,單體多巴胺在500～1 700 cm-1處有很多密集的峰,但聚合成PDANSs后該范圍的峰幾乎消失,證明了PDANSs的成功合成。

圖15 DA與PDANSs的拉曼光譜表征Fig.15 Raman spectroscopic characterization of DA and PDANSs

圖16 DA與PDANSs的紅外光譜表征Fig.16 FT-IR spectrum of DA and PDANSs

2.3 復合納米探針的構建及表征

2.3.1 DNA 組裝結構軟件模擬及電泳表征

對組裝的DNA 結構進行了軟件模擬,如圖17所示。在對制備的CDs和PDANSs進行各種表征后,將兩種納米材料與設計的DNA 鏈進行了整體連接,然后對構建成功的納米探針進行了凝膠電泳表征,見圖18。

圖17 DNA zyme結構圖Fig.17 Structure diagram of DNA zyme

圖18 DNA zyme的凝膠電泳圖Fig.18 Gel electrophoresis diagram of DNA zyme

圖18 中,泳道a 為DNA marker,泳道b 為miRNA-21,泳道c為zyme鏈,泳道d為sub鏈,泳道e為zyme+sub,泳道f為zyme+sub+miRNA-21+Mg2+。從圖18看出,泳道b、c、d 3條單鏈條帶清晰,不含雜質;泳道e是zyme鏈和sub鏈的結合,條帶明顯上移;泳道f是加入miRNA-21 和Mg2+后組裝的DNA 結構被切割,條帶實現分離,證明了在本次實驗中DNA結構的成功構建與切割。

2.3.2 復合納米探針的抗污染效果及親水性測定

PDANSs的表面黏著性較高,容易吸附一些其他干擾物質,影響miRNA-21 的測定?；诖?設計在PDANSs表面連接一段抗污染多肽,用來提高PDANSs的抗污染性能。

圖19是通過PDANSs包裹多肽前后對于修飾FITC的BSA 的吸附能力進行驗證,來證明包裹多肽后的PDANSs的抗污染效果。

圖19 PDANSs包裹多肽前后的抗污染效果Fig.19 Anti-pollution effect of PDANSs before and after wrapping polypeptide

由圖19可以看出,在未包裹多肽時,隨著混合時間的延長,BSA 被吸附的量增多,則上清液的熒光降低;而包裹多肽后與修飾FITC 的BSA 進行混合后發現,混合相同的時間,上清液的熒光明顯增強,這說明包裹多肽后的PDANSs對BSA 的吸附量是明顯低于包裹多肽前的。證明了包裹多肽對于PDANSs是有一定的抗污染效果的。

之后對于材料的構建進行了親水性驗證實驗,如圖20所示。圖20(a)為二次水空白對照,接觸角為58.33°,圖20(b)為PDANSs,表面含有豐富的官能團導致親水性較好,接觸角較小,為36.16°,圖20(c)為PDANSs包裹一層多肽,因為多肽具有良好的親水性,導致接觸角進一步減小至18.33°,圖20(d)為納米材料與DNA 連接后的接觸角,DNA 良好的親水性導致接觸角很小,低至9.90°,圖20(e)是指包裹多肽后的納米材料與DNA 連接后的接觸角測定,由于多肽與DNA 本身的親水特性,導致接觸角進一步減小至8.34°。由此可見,該納米探針的親水性非常好,表明具有良好的抗污染效果。

圖20 復合納米材料的親水性測定Fig.20 Contact angles images of different samples

2.3.3 miRNA-21的體外檢測

2.3.3.1 時間優化

為了驗證實驗設計合成的納米探針對于癌細胞中標志物miRNA-21的響應能力,首先在體外分別對不同反應時間及不同濃度的miRNA-21 進行了熒光強度的測定。

圖21 所示為反應時間與CDs及TAMRA-N的熒光強度關系, 而圖22是其更直觀的線性關系。從中可以看出,隨著反應時間的不斷增加,其熒光強度剛開始迅速增強,隨后增強速度減緩,之后在50 min左右可以達到熒光強度比較穩定的狀態,所以最終選擇50 min作為最佳反應時間。

2.3.3.2 工作曲線

以50 min作為最佳反應時間,對不同濃度的miRNA-21進行了熒光強度測定,見圖23。

圖23 miRNA檢測的熒光恢復曲線Fig.23 Optimization of reaction time for miRNA detection

由圖23可以發現,隨著miRNA-21 濃度的不斷增加,CDs及TAMRA-N 的熒光逐漸恢復,且呈現良好的線性相關性,見圖24,線性相關系數R2為0.995,計算的最低檢測限達30 pmol·L-1,遠低于大部分報道的miRNA-21檢測限,說明此次設計合成的納米探針對于癌細胞標志物miRNA-21 的檢測是十分靈敏和有效的。

圖24 以585nm 處的熒光值為縱坐標,濃度的對數為橫坐標繪制散點圖及其擬合曲線(其中線性相關系數R 2=0.995)Fig.24 Draw a scatter plot with the fluorescence at 585 nm as the ordinate and the logarithm of the concentration as the abscissa.(And draw a fitting curve(the linear correlation coefficient R 2=0.995)

2.3.3.3 選擇性測定

與此同時,還選擇了miRNA-21 的同源性miRNA 進行選擇性實驗,見圖25。

圖25 miRNA檢測的選擇性優化Fig.25 Selective optimization of miRNA detection

如圖25所示,發現本次實驗設計合成的納米探針對于其余的同源性miRNA 并沒有明顯的熒光響應,證明該納米探針對于miRNA-21的檢測具有良好的特異性,可以用于癌細胞中miRNA-21的檢測。

2.3.4 miRNA-21檢測的細胞成像實驗

2.3.4.1 細胞毒性

該納米探針在體外對miRNA-21 優異的檢測性能促使進行細胞內miRNA-21 成像。首先選擇了miRNA-21高表達的Hep G2細胞對其進行了細胞毒性驗證,發現無論是CDs、PDANSs、納米探針還是在不同濃度、不同時間條件下進行的細胞實驗,均沒有發現明顯的細胞毒性(圖26～圖28)。

圖26 納米材料對細胞活力的影響Fig.26 Cell viabilities of different nanomaterials

圖27 不同濃度納米探針對細胞活力的影響Fig.27 Cell viabilities of different concentrations of composite nanoprobes

圖28 納米探針孵育時間對細胞活力的影響Fig.28 Cell viabilities of different nanoprobes incubated for different times

2.3.4.2 復合納米探針濃度及細胞孵育時間條件優化

驗證納米探針對Hep G2細胞存活率沒有明顯影響后,對其進行了細胞成像實驗,見圖29。

圖29 關于濃度篩選的細胞成像Fig.29 Cell imaging for concentration screening

首先圖29中對細胞成像所用的納米探針濃度進行了篩選,發現在20μg·m L-1時可以達到比較穩定的熒光強度。

接下來以20μg·m L-1納米探針進行了時間優化成像,發現隨著孵育時間的延長,其熒光強度逐漸增強,在與細胞共同孵育6 h后可以達到比較穩定的成像狀態(圖30)。

圖30 細胞內納米探針孵育不同時間的熒光成像Fig.30 Verification of intracellular double fluorescence imaging

2.3.4.3 細胞內雙熒光成像驗證

基于本實驗涉及到雙熒光檢測,以20μg·m L-1納米探針與細胞共孵育6 h后,對于兩個不同通道的熒光同時進行了細胞成像,見圖31。

圖31 細胞內雙熒光成像驗證Fig.31 Fluorescence imaging of intracellular nanoprobe incubated for different times

如圖31所示,可以發現在410 nm 及543 nm通道的激光照射下,納米探針與細胞共孵育后會發現明顯的紅色、橙色雙通道熒光成像,說明雙通道熒光可同時用于癌細胞的miRNA-21檢測成像。

2.3.4.4 加入模擬物與抑制劑后的成像實驗

圖32驗證了在加入抑制劑與模擬物后的細胞成像效果,加入抑制劑后熒光信號明顯減弱,而加入模擬物后熒光信號明顯增強,說明該系統可以成功地用于檢測預刺激后miRNA 表達水平的波動。

圖32 分別加入模擬物和抑制劑的細胞成像Fig.32 Cell imaging with mimics and inhibitor respectively

4 結 語

為進一步幫助解決癌癥標志物miRNA-21 的檢測靈敏度與準確性這一難題,本課題組設計了這樣一種循環放大檢測納米系統。將兩種具有良好生物相容性及低細胞毒性的納米材料CDs、PDANSs與DNA 進行組裝,形成對miRNA-21具有特異性檢測的納米探針。該納米探針不僅具有雙熒光檢測信號,而且具有循環放大功能,大大降低檢測限,且對其它同源性miRNA 并無明顯響應,可實現靶標miRNA-21的循環放大檢測,進而大大提高檢測的靈敏度及準確性。而且CDs的紅色發射具有更高的成像深度,使其具有一定的體內檢測優勢。PDANSs表面連接的多肽既提高了納米探針的親水性,又大大減少了其他蛋白的干擾,具有良好的抗污染特性。該納米探針優異的檢測性能對于miRNA 的功能進行深入研究具有重要意義,而且有望擴展到其他生物分子的放大檢測,對于早起癌癥的診斷與預防具有深遠影響。