小麥GzCIPK7-5B 基因的生物信息學及表達分析

趙鵬鵬 李魯華 任明見 安暢 洪鼎立 李欣 徐如宏

（貴州大學農學院/國家小麥改良中心貴州分中心，550025，貴州貴陽）

小麥（TriticumaestivumL.）是我國重要的糧食作物之一，在其生長發育過程中，會遭遇各種非生物脅迫，進而嚴重影響產量與品質。鈣調磷酸酶B 類似蛋白互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，CIPKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能與鈣離子感受器——鈣調磷酸酶B 樣蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）相互作用，形成復雜的信號傳遞系統/網絡[1]及響應干旱[2]、高溫[3]、低溫[4]和鹽[5]等多種非生物脅迫以及應答激素信號[6-7]。

許多植物中都發現CIPKs 家族基因，如水稻、擬南芥、大麥、玉米、小麥和豌豆等[8-9]。研究[2]表明，在非生物脅迫響應方面，小麥TaCIPK2、TaCIPK27和TaCIPK23基因在擬南芥中異源過表達，可增強轉基因植株的耐旱性。ZmCIPKHT基因的表達受高溫脅迫的顯著誘導，該基因的擬南芥過表達株系對高溫脅迫表現出耐受性[3]。CIPK7在擬南芥中與冷誘導的CBL1相互作用，在冷反應中發揮作用，提升了擬南芥在冷脅迫中的耐受性[10]。CIPK24在擬南芥中過量表達提高了植物對Na+的耐受能力[11]。而OsCIPK03、OsCIPK12和OsCIPK15在水稻中過量表達可提高轉基因植株的耐寒、耐旱和耐鹽能力[12]。TaCIPK25過表達增強了小麥對鹽脅迫的敏感性[13]。在植物對礦質營養吸收及植物生長方面，有研究[14]表明，AtCIPK23在擬南芥中通過影響鐵螯合還原酶活性參與鐵的獲取。CIPK18在NHX5 和NHX6 介導擬南芥Li+穩態中起重要作用，且協同控制幼苗生長[15]。此外，有研究[16]發現，高濃度的蔗糖載體能夠結合到UFGT1 的特異位點抑制其活性，從而抑制草莓花青素的合成，而鈣/鈣調蛋白能夠特異地結合到UFGT1 與域間鏈接器部分重疊的位點，進而顯著緩解底物的抑制作用。擬南芥中鈣調蛋白結合蛋白CBP60g 也能夠通過負調控花青素合成的結構基因（CHS、CHI和DFR）及調控基因（如PAP1）抑制蔗糖誘導的花青素積累[17]?？芍?，鈣離子信號通路蛋白能夠通過調控蔗糖途徑參與花青素合成的生物學過程。

目前，在紫粒小麥花青素合成途徑的結構基因方面取得了較好的研究基礎，然而由于小麥基因存在于不同染色體的多拷貝以及多轉錄本等現象，關于其他途徑如鈣離子信號途徑和植物激素信號途徑等相關基因調控花青素合成的研究較少。CIPKs 家族是鈣離子信號途徑中重要的蛋白家族，且GzCIPK7-5B基因在影響小麥籽?；ㄇ嗨氐南嚓P研究鮮有報道。因此，本研究以特色小麥品種貴紫麥1 號為試驗材料，使用RT-PCR 克隆獲得GzCIPK7-5B基因，進行生物信息學分析以及實時熒光定量驗證分析，為GzCIPK7-5B基因的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以特色小麥品種貴紫麥1 號（Triticum aestivumL.cv.Guizi 1，GZ1，審定編號為黔麥2015003）為材料，種植于貴州大學農學院，取15d苗齡的根、莖、葉以及花后10、25、35d 的籽粒為樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 從前期轉錄組數據庫中篩選出GzCIPK7-5B基因，根據基因登錄號從Ensembl Plants 數據庫中下載目的基因核苷酸序列，使用Primer 5.0 設計特異性引物（表1），用于GzCIPK7-5B基因擴增、RT-PCR 和熒光定量PCR，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 試驗所使用的特異性引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.2 總RNA 提取與cDNA 的合成 選取生長一致的15d 苗齡幼苗，利用植物總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總RNA。分別用紫外分光光度計以及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的濃度和質量。選取可用的RNA 使用試劑盒（FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，天根）進行反轉錄，獲得根、莖、葉、籽粒cDNA。

1.2.3GzCIPK7-5B基因的克隆 以貴紫麥1 號15d 苗齡葉片cDNA 為模板，使用超保真DNA 聚合酶對該基因進行PCR 擴增，50μL PCR 反應體系為2×Phanta 最大緩沖液25μL、dNTP 混合物1μL、上、下游引物各2μL、超保真DNA 聚合酶1μL、DNA 模板1.5μL、ddH2O 17.5μL。擴增程序為預變性95℃3min；變性95℃15s，退火61℃15s，延伸72℃120s，循環34 次；修復延伸72℃10min，于4℃保存。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，條件為80V/cm 電壓，穩定10min 后，再升高電壓到120V/cm 40min，得到目的條帶。將目的基因的PCR產物送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析使用在線軟件對GzCIPK7-5B基因進行生物信息學分析，包括氨基酸多重序列比對、進化樹構建、蛋白的理化參數分析、磷酸化位點和亞細胞定位預測、蛋白質結構與功能預測，具體見表2。

表2 生物信息學分析軟件及用途Table 2 Softwares and usage of biological information analysis

1.2.5 表達譜分析選用貴紫麥1 號15d 幼苗的根、莖、葉和花后10d 時籽粒的cDNA，用特異性引物（表1）進行RT-PCR 檢測GzCIPK7-5B在各組織的表達情況。以反轉錄得到的cDNA 為模板進行PCR 檢測。PCR 反應體系包括DNA 模板1μL、ddH2O 4.5μL、2×TaqPCR 混合物Ⅱ12.5μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL，總體積20μL。PCR 反應條件為94℃5min；94℃30s，41.5℃30s，72℃1min 34 個循環；72℃5min；4℃進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號花青素合成重要時期相對表達量 選用貴紫麥1 號花后10、25、35d時的籽粒cDNA，用特異性引物（表1）及qRT-PCR檢測花后10、25、35d 時籽粒中GzCIPK7-5B表達情況與趨勢。反應體系為cDNA 1μL、2×Talent qPCR 預混物(熒光染料摻入法)10μL、ddH2O 7.8μL、上游引物（10μmol/L）0.6μL、下游引物（10μmol/L）0.6μL，總體積20μL。反應條件為95℃預變性2min；95℃變性15s，41.5℃退火30s，72℃延伸20s，40 個循環，每個待測樣設置3 個重復。以Actin 為內參基因，采用2-??CT法計算目的基因表達量。

2 結果與分析

2.1 GzCIPK7-5B 基因的克隆

以貴紫麥1 號15d 苗齡葉的cDNA 為模板，利用特異性引物進行PCR 擴增（表1），凝膠電泳檢測（圖1）顯示，GzCIPK7-5B基因（Genebank 登錄號為TraesCS5B02G381500）在1296bp 有明顯的條帶。符合目的基因序列的長度。測序結果表明，擴增出來的基因序列與TaCIPK7-5B一致，將其命名為GzCIPK7-5B。

圖1 GzCIPK7-5B 的PCR 擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification and electrophoresis of GzCIPK7-5B gene

2.2 GzCIPK7-5B 編碼蛋白理化性質分析與亞細胞定位預測

利用在線工具ExPASy-ProtParam 對蛋白的理化性質進行分析。圖2 顯示，該蛋白的分子式為C2087H3370N606O596S20，等電點（pI）為8.82，總原子數為6679，分子量為47 128.62，帶負電荷的氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為50，帶正電荷的氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為55。其編碼的氨基酸數量為431 個，其中亮氨酸含量最高，為63 個，占氨基酸總數的14.6%，脂肪指數為96.68，不穩定系數為53.83，表明此蛋白為不穩定性蛋白。

圖2 GzCIPK7-5B 的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of GzCIPK7-5B

利用Cell-PLoc2.0 進行亞細胞定位預測分析，分析結果顯示該蛋白定位在細胞核。

2.3 GzCIPK7-5B 編碼蛋白功能結構域、信號肽與親疏水性分析

在NCBI 中利用CD search 對編碼的蛋白進行保守結構域預測，結果（圖3）顯示，該蛋白含有絲氨酸―蘇氨酸蛋白激酶家族保守結構域，分別是絲氨酸―蘇氨酸蛋白激酶區和CBL 結合區即NAF結構域，同時還具有ATP 結合區，具有CIPK 家族基因的特征。

圖3 GzCIPK7-5B 的保守結構域預測Fig.3 Prediction of amino acid conservative domain in GzCIPK7-5B

利用SingalP 5.0 Server 與SingalP 3.0 Server進行蛋白質信號肽分析。SingalP 5.0 Server 結果（圖4）顯示，編碼蛋白具有信號肽的可能性為0.0007，推測該蛋白無信號肽；SingalP 3.0 Server結果顯示，基因編碼的蛋白為非分泌蛋白（D值為0.14）。

圖4 GzCIPK7-5B 蛋白信號肽預測Fig.4 Prediction of signal peptide of GzCIPK7-5B protein

通過在線工具ProtScale 預測編碼蛋白的親疏水性，分析結果（圖5）顯示，該蛋白第213 個氨基酸表現最大疏水性，為2.79，第331 個氨基酸表現最大親水性，為-3.69，親水平均系數為-0.08，小于0，故推測編碼蛋白為親水性蛋白。

圖5 GzCIPK7-5B 蛋白親疏水性預測Fig.5 Prediction of affinity and hydrophobicity of GzCIPK7-5B protein

2.4 GzCIPK7-5B 編碼蛋白跨膜結構域及磷酸化位點預測

利用工具TMHMM 和NetPhos 3.1Server 對蛋白質序列進行跨膜結構域預測（圖6），發現此蛋白質無明顯的跨膜區域，說明該蛋白不具有轉運蛋白相關功能的基礎結構。

圖6 GzCIPK7-5B 蛋白跨膜結構預測Fig.6 Prediction of transmembrane structure of GzCIPK7-5B protein

磷酸化位點分析結果（圖7）顯示，此蛋白有29 個磷酸化位點，其中絲氨酸（Serine）21 個、蘇氨酸（Threonine）7 個、酪氨酸（Tyrosine）1 個。其中最有可能的潛在磷酸化位點是第142、172、282、331、341 和381 位的絲氨酸，它們的值均高于0.95，遠遠超過標準值（0.5），同時這一結果也表明，編碼的蛋白可能通過調控相應位點的磷酸化來實現其功能。

圖7 GzCIPK7-5B 蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Prediction of phosphorylation site of GzCIPK7-5B protein

2.5 GzCIPK7-5B 編碼蛋白二、三級結構預測分析

利用SOPMA 在線網站分析編碼蛋白的二級結構（圖8）發現，該蛋白由α-螺旋（有155 個氨基酸，占35.96%）、無規則卷曲（有155 個氨基酸，占35.96%）、延伸鏈（有81 個氨基酸，占18.80%）和β-轉角（有40 個氨基酸，占9.28%）二級結構組成。

圖8 GzCIPK7-5B 蛋白二級結構預測Fig.8 Prediction of secondary structure of GzCIPK7-5B protein

使用SWISS-MODEL 進行三級結構預測，結果（圖9）顯示，該蛋白三級結構由1 個PDB 號為6c9d.1.A 的結構為模板建立，6c9d.1.A 屬于KA1自抑制MARK1 激酶（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）的晶體結構，序列一致性為31.34%。推測蛋白可能參與相關激酶的合成。

圖9 GzCIPK7-5B 蛋白三級結構預測Fig.9 Prediction of tertiary structure of GzCIPK7-5B protein

2.6 GzCIPK7-5B 基因進化樹分析與同源氨基酸序列比對

在NCBI 數據庫中獲取野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）和擬南芥（Arabidopsisthaliana）等15 個物種的CIPK 家族蛋白基因，利用MEGA7.0進行同源性聚類分析，構建系統進化樹，結果（圖10）顯示，GzCIPK7-5B基因與野生二粒小麥TdCIPK7-5B、AtCIPK7-5D、TdCIPK7-5A和TaCIPK7同源性較高。利用DNAMAN 將GzCIPK7-5B與野生二粒小麥TdCIPK7-5B、節節麥AtCIPK7-5D、野生二粒小麥TdCIPK7-5A、小麥TaCIPK7和小麥TaCIPK7-5A基因的蛋白質序列進行同源性序列比對，結果（圖11）顯示，它們的同源性分別為100.00%、99.07%、98.84%、98.61%和98.61%。綜合多重序列比對和系統進化樹分析，可知GzCIPK7-5B在小麥中相對保守，與野生二粒小麥的TdCIPK7-5B在生物學功能上更為接近。

圖10 GzCIPK7-5B 基因的進化樹分析Fig.10 Phylogenetic tree analysis of GzCIPK7-5B gene

圖11 GzCIPK7-5B 氨基酸多重序列比對Fig.11 Multiple sequence alignment of amino acids GzCIPK7-5B

2.7 GzCIPK7-5B 基因的表達譜分析

為了分析GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號不同組織中的表達，取15d 苗齡幼苗的根、莖、葉以及花后10d 時的籽粒為樣品，以cDNA 為模板，Actin 為內參基因，進行RT-PCR 檢測。結果（圖12）顯示，GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號的根、莖、葉、籽粒中均有表達，葉與根中表達量高于莖和籽粒。

圖12 GzCIPK7-5B 的表達譜分析Fig.12 Expression profile analysis of GzCIPK7-5B

2.8 GzCIPK7-5B 在貴紫麥1 號籽?；ㄇ嗨睾铣芍匾獣r期的相對表達量

分析前期貴紫麥1 號不同灌漿時期花青素積累的轉錄組數據發現，GzCIPK-7-5B在不同時期差異表達。為了確定GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號籽?；ㄇ嗨睾铣芍匾獣r期的表達變化水平，取花后10、25、35d 時的籽粒為樣品進行qRT-PCR 驗證。結果（圖13）顯示，在籽粒發育的3 個時期中，與花后10d時相比，在25d 時GzCIPK7-5B顯著升高，然后在35d 時降低，且25 和35d 時極顯著上調（P＜0.01）。

圖13 GzCIPK7-5B 在貴紫麥1 號籽?；ㄇ嗨睾铣申P鍵期的相對表達量Fig.13 Relative expression levels of GzCIPK7-5B in the critical period of anthocyanin synthesis in GZ1 grains

3 討論

作為植物中普遍存在的激酶，CIPKs 在逆境脅迫信號傳導中起著重要作用。它能與鈣離子感應蛋白CBL 結合實現信號轉導，激活下游相關基因。CIPKs 蛋白具有2 個特定的結構域，分別為N 端的蛋白激酶催化結構域和C 端的調節結構域。其中C端含有特定的由24 個氨基酸組成的高度保守的NAF 結構域。目前在許多植物中都鑒定出了該家族的基因，如水稻[18]、玉米[8]、擬南芥[18]和高粱[19]等。本研究中，GzCIPK7-5B具有該家族典型的N端蛋白激酶催化結構域和NAF 結構域，說明GzCIPK7-5B具有該家族的相似功能。

CIPKs 家族基因響應多種非生物脅迫。研究[20]發現，干旱和高鹽脅迫顯著誘導小麥TaCIPK23基因的表達。谷子SiCIPK16基因在低溫脅迫下表達量呈現上調[21]。CIPK8基因在大豆中響應干旱脅迫，根和葉表達量呈上調[22]。在紫花苜蓿中，不僅對干旱有響應，還對低溫和鹽脅迫有應答[23]。此外，CBL-CIPKs 網絡還參與調節礦質元素的吸收和轉運。研究表明，CIPK23參與調節根系對K+的吸收[24-25]，通過對高鐵還原酶活性的調節參與擬南芥對鐵的獲取[14]，還涉及通過磷酸化轉運體（CHL）調節CHL 對硝酸鹽的親和力[26]。GzCIPK7-5B具有CIPKs 家族的典型特征，可能對干旱、低溫和高鹽等脅迫存在響應以及與礦質營養元素吸收有關。因此，該基因在小麥中的具體功能值得進一步研究。

CIPKs 家族基因在植物不同組織中廣泛表達[27-28]，本研究中，貴紫麥1 號GzCIPK7-5B的表達也有一定差異，其在根、莖、葉和籽粒中均有表達，根和葉中表達水平高于莖和籽粒?？赡茉谠摃r期GzCIPK7-5B對根系和葉的生長發育影響較大。GzCIPK7-5B屬于鈣離子信號通路系統中的鈣調磷酸酶B 類似蛋白互作蛋白激酶基因，且在貴紫麥1號籽?；ㄇ嗨厣锖铣? 個重要時期（花后10、25、35d），相比于10d，GzCIPK7-5B基因的表達量在25 和35d 時顯著上調，表明該基因與小麥籽?；ㄇ嗨氐姆e累有關。

4 結論

GzCIPK7-5B具有CIPKs 家族的典型特征。CDS 序列長1296bp，編碼431 個氨基酸，蛋白含有29 個磷酸化位點，無跨膜結構，是一種無信號肽的不穩定親水性質的核蛋白。該基因與野生二粒小麥TdCIPK7-5B的序列相似度最高，亞細胞定位顯示該基因定位于細胞核。GzCIPK7-5B在根、莖、葉、籽粒表達具有組織特異性，在籽?；ㄇ嗨睾铣申P鍵期表達量具有顯著變化，其中在花后25 和35d表達水平較10d 時顯著升高。該結果豐富了小麥CIPK7基因資源，也為探討鈣離子信號途徑參與小麥籽?；ㄇ嗨胤e累奠定了基礎。