金蕎不同器官提取物對幾種雜草種子萌發的影響及其安全性研究

歐陽屹南 劉洋 沈倫豪 任奎 趙輝 唐新科 周美亮

（1 湖南科技大學生命科學與健康學院，411201，湖南湘潭；2 中國農業科學院作物科學研究所，100081，北京；3 西南大學農業與生物科技學院，400715，重慶）

田間雜草防治一直是我國農業生產中十分關鍵的環節。我國1400 余種雜草中具有嚴重危害性的有130 余種，在雜草防治年投入235 億元的情況下，因雜草而造成的作物減產仍然高達5000萬t[1]。目前，我國農田雜草防控方式主要為人工除草和化學除草，前者效率低，不利于農業產業化發展，而后者會造成嚴重的環境污染[2]。相比之下，生物除草具有高效低毒和安全可靠的特點，且能夠實現可持續發展，符合人與自然和諧發展的理念，在未來農業發展中將占據重要地位[3]。

化感作用是植物產生和釋放的防御性代謝產物（化感物質）對同種或異種植物產生負面影響的一種干擾機制。植物化感物質主要為次生代謝物，其成分復雜且存在一物多效和一效多物現象?；凶饔米鳛橹参镞m應環境的一種機制，作用溫和卻行之有效，并具有一定的特異性，不同的植物具有不同甚至相反的化感作用[4]。植物化感作用的研究一直是生物除草極為關鍵的環節。

在農業生產實踐中，研究發現，蕎麥對某些雜草具有一定的抑制作用，不管是輪作、間作[5-6]還是化感防治[7-8]等都表現出較好的效果，目前蕎麥雜草防控技術越來越成熟，應用也越來越廣泛。其中，金蕎（Fagopyrumcymosum）表現出明顯的抑草作用，可能主要來源于其發達的根系、快速的生長、寬廣的空間占比和化感物質分泌[9]。

金蕎是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（FagopyrumMill.）多年生雙子葉草本植物，是蕎麥屬中主要的野生種[10]。金蕎作為藥食兩用作物[11]，在中國及其他國家均具有悠久的種植歷史[12]。金蕎生藥及化學成分主要為一類原花色素苷類縮合型單寧混合物，還含有鞣質類、黃酮類、苷類、甾體類、萜類、揮發油類和有機物類化合物等[13-14]。與大多數植物類似，金蕎分泌的化感物質大多為親脂性[4]。為全面探究金蕎化感物質對雜草的抑制效果，本研究選取低毒有機溶劑提取金蕎的活性物質，采用MS 培養基法和濾紙法比較研究了金蕎根、莖、葉3 個器官的化感物質對3 種雜草種子萌發的影響，并對其安全性進行評估[2]，為蕎麥雜草防控技術在農業生產中的應用提供理論依據和科學指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草本植物種子為擬南芥（Arabidopsis thaliana）、黑麥草（Loliumperenne）、羊茅（Festuca ovina）和波斯菊（Cosmosbipinnata）[15]，均由中國農業科學院蔬菜花卉研究所提供。供試作物種子為金蕎、甜蕎（Fagopyrumesculentum）、苦蕎（Fagopyrumtataricum）、燕麥（Avenasativa）、小麥（Triticumaestivum）和大麥（Hordeumvulgare），均由中國農業科學院作物科學研究所提供。

1.2 金蕎提取物的制備

取金蕎新鮮根、莖、葉洗凈，烘箱65℃處理4～5h 至恒重，使用粉碎機粉碎，過40 目篩。稱取1g 粉末，以1g:30mL 的料液比混合粉末和提取劑（蒸餾水，或75%乙醇，或75%甲醇），用50℃超聲波處理30min，4 層紗布過濾取濾液（或8000轉/min 離心5～10min 后取上清液，根據不同部位提取物適當調整離心條件），用0.22μm 濾膜抽濾，即為蕎麥提取物原液。用蒸餾水將不同種類和體積的原液定容至一定體積制成后續所需的稀釋液，并用0.22μm 針筒過濾除菌，密封避光保存備用[16]。

1.3 種子處理

1.3.1 種子滅菌 擬南芥：取1/4 體積種子于2mL離心管中，加入2mL 75%乙醇持續上下顛倒10min后倒掉液體，加入2mL 無水乙醇上下顛倒滅菌10min，晾置數小時至完全干燥?？嗍w、甜蕎和雜草種子：取1/4 體積種子于50mL 離心管中，加入50mL 10%NaClO 持續上下顛倒7min 后倒掉液體，加入50mL 75%乙醇持續上下顛倒滅菌5min 后倒掉液體，加入50mL 無菌水上下顛倒洗刷數次，重復用無菌水洗刷5～6 次，倒掉液體，晾置數小時至完全干燥。燕麥、小麥和大麥種子：取1/4 體積種子于50mL 離心管中，加入1%H2O250mL 搖勻后4℃冰箱靜置過夜，在無菌超凈臺中用無菌水洗5～6次，倒掉液體，晾置數小時至完全干燥，以上均嚴格遵守無菌操作。

1.3.2 制備MS 固體培養基 MS 培養基（1L）：稱取4.43g MS 粉末（Murashige skoeg Basal Medium with Vitamin）和30g蔗糖，溶解定容至1L，用5mol/L NaOH 溶液調節pH 至5.8～6.2，加入植物凝膠2.7g，高壓蒸汽滅菌。含稀釋液的MS 培養基（1L）：定容900mL，在無菌超凈臺中分別將25%、50%和100%的無菌稀釋液以1:9 的比例混合制成不同終濃度的培養基，每個培養皿倒入25mL 培養基，凝固后避光常溫放置。

1.3.3 提取和處理方法 如表1 所示，為獲取合理的提取和處理方法，選取水（對照，CK）、75%乙醇及75%甲醇為溶劑，利用超聲波提取根、莖、葉的等比粉末，得到提取物，并分別以3 種溶劑和提取物為稀釋液，擬南芥為受試植物，觀察不同溶劑和濃度的金蕎提取物對擬南芥萌發的影響[16]。

表1 不同溶劑及濃度的金蕎提取物處理Table 1 Treatments of F.cymosum extract with different solvents and concentration

1.3.4 種子培養 每板50 粒擬南芥種子均勻播種至培養基中。雜草種子和作物種子均采用濾紙萌發的方法，每個培養皿鋪3 層滅菌濾紙，加入6mL稀釋液，其中雜草種子播種30 粒，作物種子播種20 粒。所有種子播種后均在4℃冰箱中放置48h，之后置于28℃恒溫培養室黑暗培養7d，計算每天的萌發率（germination rate），3d 時計算種子的發芽指數及化感效應指數，7d 時計算種子的發芽率（germination percentage，GP）等指標。

計算公式如下，萌發率（%）=（第t天發芽種子數/受試種子數）×100；GP（%）=（第7 天發芽種子數/受試種子數）×100；發芽指數（germination index，GI）=∑(Gt/Dt)；化感效應指數（response index，RI）=1–(C/T)，（T≥C）或RI=(T/C)–1，（T

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel Office 16 作圖，用Origin 2021 進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 對擬南芥種子萌發的影響

如圖1 和表2 所示，2.5%、5%、10%的乙醇溶劑和10%的甲醇溶劑能完全抑制擬南芥種子萌發，發芽率均為0.00%。3 種濃度下水提物處理的擬南芥種子萌發趨勢為隨濃度的升高而降低，在1～4d存在顯著性差異，萌發化感效應指數分別為0.58、0.13 和-0.49，但5～7d 的生長曲線和發芽率與CK基本一致，說明金蕎水提物在擬南芥萌發初期有明顯的化感作用，且呈現“低促高抑”的現象。甲醇提取物相較于甲醇對擬南芥種子萌發的抑制作用更明顯，2.5%和5.0%甲醇提取物的化感效應指數分別為-0.78 和-1.00，比較兩者的萌發曲線和生長狀況（圖1）可知，5.0%甲醇提取物對擬南芥種子萌發的抑制作用高于2.5%濃度。同時，鑒于蕎麥中絕大多數作用于植物的鞣質類、黃酮類和苷類等化感物質均難溶于水[14]，選取75%甲醇為溶劑，5.0%為稀釋液濃度為后續金蕎不同器官提取物的作用條件。

圖1 不同金蕎提取物處理7d 后擬南芥種子的萌發情況Fig.1 Germination of A.thaliana seeds treated with different F.cymosum extracts for seven days

表2 不同溶劑及濃度的金蕎提取物對擬南芥種子萌發的影響Table 2 Effects of F.cymosum extracts with different solvents and concentrations on seed germination of A.thaliana

2.2 對雜草種子萌發的影響

2.2.1 對黑麥草種子萌發的影響 如表3 和圖2 所示，水、甲醇溶液和根提取物處理的種子7d 萌發率曲線沒有顯著差異，莖和葉的甲醇提取物在種子萌發第1 天呈現明顯的抑制作用。其中莖甲醇提取物的萌發化感效應指數與CK 有顯著性差異。說明5.0%金蕎莖甲醇提取物可明顯抑制黑麥草種子初期的萌發。

圖2 不同金蕎提取物處理7d 后3 種草本植物種子的萌發情況Fig.2 Germination of seeds of three herbaceous plants treated with different buckwheat extracts for seven days

表3 金蕎不同器官甲醇提取物對黑麥草種子萌發的影響Table 3 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of L.perenne

2.2.2 對羊茅種子萌發的影響 如表4 和圖2 所示，5 組處理的羊茅種子1～4d 萌發率曲線沒有顯著性差異，金蕎根、莖、葉提取物處理均呈負向的化感作用，化感效應指數分別為-0.43、-0.33 和-0.39。但7d 的萌發率曲線中，金蕎提取物的化感效應在5～7d 對羊茅種子萌發的影響最大，且莖提取物處理在第5 天相較于CK 有明顯的抑制作用。

表4 金蕎不同器官甲醇提取物對羊茅種子萌發的影響Table 4 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.ovina

2.2.3 對波斯菊種子萌發的影響 如表5 和圖2 所示，相較于CK，甲醇和金蕎根、莖、葉甲醇提取物處理的波斯菊種子7d 的萌發率沒有顯著性差異，發芽率和發芽指數同樣沒有明顯變化。說明金蕎提取物對波斯菊種子萌發沒有明顯的化感作用。

表5 金蕎不同器官甲醇提取物對波斯菊種子萌發的影響Table 5 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of C.bipinnata

2.3 對作物種子發芽的安全性分析

2.3.1 對甜蕎種子萌發的影響 如圖3 和表6 所示，相較于CK，甲醇和3 種金蕎提取物處理下甜蕎種子7d 的萌發率和發芽指數均無顯著性差異。其中莖提取物處理的種子發芽指數偏低，與葉提取物處理呈現顯著性差異，但與CK 沒有明顯差異。故種植甜蕎時可以使用低濃度的金蕎甲醇提取物研制除草劑。根據化感效應指數，使用的優先級為葉提取物（0.18）＞根提取物（-0.13）＞莖提取物（-0.40）。

圖3 金蕎不同器官甲醇提取物處理7d 后5 種作物種子萌發情況Fig.3 Seed germination of five crops after seven days of treatment with methanol extracts from different F.cymosum organs

表6 金蕎不同器官甲醇提取物對甜蕎種子萌發的影響Table 6 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.esculentum

2.3.2 對苦蕎種子萌發的影響 如圖3 和表7 所示，5 個處理對苦蕎種子萌發均無明顯抑制作用，其中葉提取物在第1 天呈現顯著的促進作用，但隨著萌發的進行萌發率差異逐漸消失。從萌發曲線、發芽率和發芽勢的對比來看，金蕎根、莖、葉的提取物在5%濃度下對苦蕎種子萌發均沒有抑制作用，故種植苦蕎時可以使用低濃度金蕎的根、莖、葉甲醇提取物研制除草劑。根據化感效應指數，使用的優先級為葉提取物（0.37）＞根提取物（0.02）＞莖提取物（0.00）。

表7 金蕎不同器官甲醇提取物對苦蕎種子萌發的影響Table 7 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of F.tataricum

2.3.3 對燕麥種子萌發的影響 如圖3 和表8 所示，5 個處理的燕麥種子萌發情況均基本一致，1～3d的萌發率、發芽率和發芽指數均無顯著性差異，說明金蕎的根、莖、葉甲醇提取物在5.0%濃度下對燕麥種子發芽沒有明顯的抑制作用，在種植燕麥時均可用于研制除草劑。根據化感效應指數，使用的優先級為莖提取物（0.05）＞根提取物（0.04）＞葉提取物（-0.11）。

表8 金蕎不同器官甲醇提取物對燕麥種子萌發的影響Table 8 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of A.sativa

2.3.4 對小麥種子萌發的影響 如圖3 和表9 所示，5 個處理的小麥種子萌發情況基本一致，1～3d萌發率、發芽率和發芽指數均無顯著性差異，說明金蕎的根、莖、葉甲醇提取物在5.0%的濃度下對燕麥種子發芽沒有明顯的抑制作用，在種植燕麥時均可以用于研制除草劑。根據化感效應指數，使用的優先級為根提取物（-0.06）＞葉提取物（-0.18）＞莖提取物（-0.22）。

表9 金蕎不同器官甲醇提取物對小麥種子萌發的影響Table 9 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of T.aestivum

2.3.5 對大麥種子萌發的影響 如圖3 和表10 所示，5 個處理的大麥種子1～3d 萌發率、發芽率和發芽指數均無顯著差異。莖和葉提取物處理的大麥種子1 和2d 萌發率和發芽指數則明顯低于CK，其中葉提取物明顯降低了大麥種子的發芽率，說明金蕎莖和葉的甲醇提取物對大麥種子的萌發有十分明顯的抑制作用。

表10 金蕎不同器官甲醇提取物對大麥種子萌發的影響Table 10 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of H.vulgare

3 討論

化感作用是植物與其他物種之間產生次生物質相互影響的一種現象[18]，產生化感作用的次生物質被稱為化感物質[19]。許多研究指出，苦蕎秸稈還田具有良好的雜草抑制效應及增產效應[6,9,20]，與此同時，蕎麥化感物質對許多雜草有明顯的抑制作用[21]，對金蕎提取物的抑草機制研究較少。金蕎生藥及化學成分主要為一類原花色素苷類縮合型單寧混合物[13-14]，與苦蕎抑制雜草的化感物質十分相似[22-25]。大多數脂溶性溶劑對植物具有一定的毒性，為了排除有機溶劑本身對雜草種子萌發的干擾，本研究以擬南芥為受試植物初步確定了金蕎活性物質發揮化感作用的最佳條件，即75%甲醇為提取溶劑，5.0%為作用濃度，研究金蕎有機溶劑提取物對黑麥草、羊茅和波斯菊3 種雜草種子萌發的影響。

植物不同器官中化感物質的種類和含量分布差異較大，研究化感物質在植物體中的分布對生物除草劑的開發和利用具有重要意義[26]。本研究提取了金蕎根、莖、葉3 個器官的活性物質，探究它們對3 種雜草種子萌發趨勢和發芽率的影響，發現提取物對單子葉雜草黑麥草和羊茅的種子萌發有明顯抑制作用，能不同程度地改變其萌發曲線，降低萌發率，而對雙子葉雜草波斯菊種子萌發的影響十分有限。據此推測，金蕎化感物質可能對單子葉草本植物有抑制特異性。

除化感物質的影響外，植物間還存在生長空間和資源的競爭[16]。在對金蕎抑草機制分析中同樣需考慮化感物質和植物競爭的協同作用。本研究中，金蕎3 種器官的甲醇提取物對雜草種子的抑制作用主要表現在萌發初期，但對種子培養7d 的發芽率影響不大。由此推測，金蕎含有的化感物質雖然不能完全抑制雜草種子的萌發，但可能通過延緩雜草種子初期的萌發，幫助金蕎在生長早期取得競爭優勢，從而進一步抑制雜草生長。

4 結論

金蕎莖5.0%甲醇提取物對黑麥草和羊茅種子萌發有明顯抑制作用，可用于黑麥草和羊茅除草劑的研究；金蕎5.0%甲醇提取物對甜蕎、苦蕎、燕麥和小麥種子萌發均沒有顯著影響，可作為生物除草材料應用。