不同水域短頜鱭腸道菌群差異分析

文嗣鑫，李樂康，李亞培，李辰鈺，龔小玲*

(1.上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.江西省水生生物保護救助中心，江西 南昌 330042；4.九江市農業科學院，江西 九江 332000)

短頜鱭(Coiliabrachygnathus)俗稱毛花魚[1]，體型似長頜鱭(Coiliamacrognathos)，二者形態上的主要區別：長頜鱭上頜骨較長，可向后延長至鰓蓋后緣，體側縱列鱗數目較多，為75～83個；而短頜鱭上頜骨不超過鰓蓋后緣，體側縱列鱗數目為68～77個。早期研究認為，短頜鱭生長、發育和繁殖均在江河湖泊內，且多在中上水層生活，并在深水層越冬，生殖期在每年4—5月，能在靜水和緩水中產卵，屬于中小型經濟魚類[2-3]。近年來研究發現，短頜鱭也存在江海洄游的個體[4]。短頜鱭在不同的生長階段食性會發生變化，幼魚主要以水中浮游動物為食，小型成體主要攝食昆蟲幼蟲、橈足類和枝角類，而大型成體主要以魚蝦為食[5-6]。

魚類腸道微生物是由宿主自身的特性和各種外界環境因素共同作用形成的，最有優勢的微生物類群一般是細菌[7]，主要由兼性厭氧菌和好氧菌組成，通常存在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)3門核心微生物，它們能夠有效調控腸道菌群結構組成，參與魚的生長和免疫，促使魚類健康生長[8]。

鄱陽湖是中國第一大淡水湖[9]，位于江西省北部，是長江中下游地區主要支流之一；而青草沙水庫位于咸、淡水交界處的長江口，短頜鱭均是鄱陽湖和青草沙水庫魚類的優勢種[10-12]，在兩種不同水域中都具有很強的適應性。魚類腸道菌群與水域環境密切相關，因此，探究不同水域短頜鱭腸道菌群差異及影響因素具有重要意義。本研究通過比較鄱陽湖和青草沙水庫中大、小兩種規格的短頜鱭腸道菌群結構差異并預測菌群功能，以期為探究短頜鱭水環境適應性機制及短頜鱭腸道菌群與宿主之間的調控關系提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 調查站位

分別于2021年11月23、24、25日對江西省九江市鄱陽湖湖口，以及2021年12月30日對上海市長江口青草沙水庫進行實地采樣。調查當日下午將網具放置在指定位置，次日上午收取。調查網具為三層刺網：單條網長100 m，高2 m，網目2a=4 cm，每個調查站位放置2條，每次放置時間約12 h。采樣點具體信息見圖1、表1。

本圖基于自然資源部標準地圖服務網站GS(2019)3333號標準地圖為底圖，底圖邊界無修改。The figure is based on the standard map GS(2019)3333 in the Standard Map Service website of Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China，with no modifications of the boundaries in the standard map.圖1 短頜鱭樣品采集站位Fig.1 Sample collection sites of Coilia brachygnathus

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在鄱陽湖湖口共采集到短頜鱭60尾，在青草沙水庫共采集到74尾。測量樣本全長和體質量，并按全長、體質量區間值劃分為大、小規格兩類，共4組。其中，青草沙水庫大、小規格短頜鱭分別記為QCS-L、QCS-S，鄱陽湖大、小規格短頜鱭分別記為PYH-L、PYH-S。大規格全長為30～35 cm，平均值為(31.58±0.74)cm，體質量為100～130 g，平均值為(120.43±5.85)g；小規格全長為15～20 cm，平均值為(17.72±1.30)cm，體質量為10～30 g，平均值為(16.85±4.53)g。

從每組隨機選取3尾短頜鱭，共12個樣本。無菌條件下，用乙醇棉球擦拭魚體表后，再用剪刀從短頜鱭肛門處將腹部剪開，分離出完整腸道。將腸道放入培養皿中，去除腸道內容物，并使用緩沖液沖洗掉腸壁上的血液、脂肪。腸道樣品用液氮速凍后置于2 mL凍存管，并于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 細菌總DNA提取和測序 根據E.Z.N.A.?soil DNA kit 抽提腸道菌群群落總DNA，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并利用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度。設計上游引物(5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3′)和下游引物(5′CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 3′)對16S rRNA V4～V5(a)可變區進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃下預變性3 min；95 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行27個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存(PCR 儀：ABI GeneAmp?9700型)。PCR 反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，DNA模板 10 ng，用滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR產物在Illumina MiSeq平臺(Illumina，San Diego，USA)上進行測序。

1.2.3 樣品OTU、菌群多樣性及群落組成分析 對測序數據進行初步篩查，對存在問題的樣品進行重測、補測。原始序列按照index和barcode信息進行文庫和樣品劃分，去除低質量序列及barcode和接頭信息。

按照QIIME 2 dada 2和Vsearch軟件的分析流程進行序列OTU聚類。依據OTU在不同樣品中的分布，評估每個樣品的Alpha多樣性水平。

在物種分類學組成層面，利用QIIME 2軟件進行分析，并結合統計學檢驗方法，進一步衡量不同樣品間的物種豐度組成差異。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群的測序質量及OTU數量

從圖2可見，隨著測序數據量的增加，各組樣品OTU數量也隨之增大，最終曲線趨于平緩，表明測序結果已足夠反映樣品所包含的多樣性，能反映不同水域短頜鱭腸道菌群組成和種類。

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curves

從圖3可見，QCS-L、QCS-S、PYH-L、PYH-S腸道菌群的平均OTU分別為524、472、466和567個，4組特有的OTU分別為 215、171、189、280個，表明QCS-L腸道菌群的多樣性比PYH-L的更高，而QCS-S腸道菌群的多樣性則比PYH-S的要低。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性

從表2可見，鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群樣品覆蓋率均接近1.0，且無顯著性差異(P>0.05)，表明樣品中未被測序的菌群概率非常低。在Alpha多樣性分析中，Chao1指數值越大，OTU數目越多，說明該樣品腸道菌群物種數較多。QCS-L的Chao1指數值比PYH-L的高，而QCS-S的Chao1指數則比PYH-S的低。表明大規格短頜鱭的腸道菌群在青草沙水庫的物種數比鄱陽湖多，而小規格則相反。

表2 鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群 Alpha 多樣性

Shannon和Simpson指數表征物種多樣性，數值越大，表示群落多樣性越高。QCS-L腸道菌群的Shannon和Simpson值比PYH-L的高，而QCS-S腸道菌群的Shannon和Simpson值則比PYH-S的低。表明大規格短頜鱭腸道菌群在青草沙水庫的群落多樣性比鄱陽湖的高，而小規格則相反。

2.3 腸道菌群Beta多樣性

PCoA分析顯示：QCS-L腸道菌群樣品主要沿PCo1坐標軸形成一個簇，與PYH-L明顯分離；沿PCo2坐標軸，QCS-S腸道菌群樣品也與PYH-S明顯分離(圖4)。Permanova分析表明，青草沙水庫與鄱陽湖大、小規格短頜鱭腸道菌群存在顯著性差異(P=0.003<0.05)。

圖4 鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群差異主成分分析Fig.4 Principal co-ordinates analysis showing the differences in intestinal bacterial communities of Coilia brachygnathus with different sizes in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

2.4 腸道菌群組成

從門分類水平將豐度大于1%的細菌類群進行統計，而將豐度小于1%的細菌類群進行合并，并命名為“others”。從圖5可見，不同水域短頜鱭腸道菌群主要分為8個門，分別是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、OD1菌門(OD1)、浮霉菌門(Planctomycetes)、衣原體門(Chlamydiae)和酸桿菌門(Acidobacteria)。每個門類細菌在不同水域短頜鱭腸道中的豐度差異較大，在大規格短頜鱭中，變形菌門和擬桿菌門在鄱陽湖中的豐度大于青草沙水庫，厚壁菌門在鄱陽湖中的豐度則小于青草沙水庫；在小規格短頜鱭中，擬桿菌門、厚壁菌門在鄱陽湖中的豐度大于青草沙水庫，變形菌門在鄱陽湖中的豐度則小于青草沙水庫。

圖5 門水平上鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群豐度Fig.5 Intestinal bacterial community abundance in Coilia brachygnathus with different sizes at phylum level in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

從圖6可見，鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群主要分為9個屬，分別是蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、鮭色沉積物桿狀菌屬(Sediminibacterium)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、念珠菌屬(Candidatus_Rhabdochlamydia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。在各組對比中，伯克霍爾德菌屬為差異性最大的菌群，其在QCS-L、PYH-L中分別占18.69%、9.28%，在QCS-S、PYH-S中分別占25.53%、12.68%。

圖6 屬水平上鄱陽湖、青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群豐度Fig.6 Intestinal bacterial community abundance in Coilia brachygnathus with different sizes at genus level in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

2.5 腸道菌群功能預測

從圖7可見，參與生物合成(biosynthesis)的代謝途徑豐度最高，其中，參與氨基酸生物合成(amino acid biosynthesis)、核苷與核苷酸生物合成(nucleoside and nucleotide biosynthesis)、脂肪酸與脂質生物合成(fatty acid and lipid biosynthesis)及輔因子(cofactor，prosthetic group，electron carrier and vitamin biosynthesis)等通路豐度較高。

圖7 鄱陽湖和青草沙水庫不同規格短頜鱭腸道菌群代謝通路豐度Fig.7 Metabolic pathway abundance of intestinal bacterial community in Coilia brachygnathus with different sizes in Poyang Lake and Qingcaosha Reservoir

3 討論

魚類腸道微生物是水環境和餌料中的微生物隨著鰓和口腔進入體內，并與魚類發生適應性生理生化作用，最終定植在魚類腸道中的菌群，因此，魚類腸道菌群的結構與其遺傳、食性和水環境密切相關[13]。Fietz等[14]在鱗柄玉筋魚(Ammodytestobianus)和尖頭富筋魚(Hyperopluslanceolatus)這兩種海洋魚類中發現，遺傳因素可能在種間和種內水平上對腸道菌群組起調節作用。鄱陽湖和青草沙水庫兩個水域小規格短頜鱭可能均為定居性群體，且在不同水域發生了遺傳分化[15]，這可能是它們腸道菌群組成差異的原因之一；由于本研究中短頜鱭樣品均為性成熟的樣品[16]，因此，腸道菌群與發育階段無關，導致其腸道菌群差異的因素還可能有食性和水環境。

3.1 腸道菌群與食性的關系

李可俊等[17]在對長江口8種野生魚類腸道菌群的比較中發現，魚類腸道結構多樣性的差異與魚類食性密切相關，食性差異越大的魚類之間腸道菌群差異也越顯著。同一種魚攝食不同種類的食物后，其消化道菌群結構也會發生改變[18-19]。本研究發現，鄱陽湖小規格短頜鱭相比大規格的腸道菌群多樣性和豐富度更高。唐渝[20]在研究太湖湖鱭種群數量變動及合理利用時發現，湖鱭胃容物包括原生動物、蝦蟹貝幼體、魚卵、水蚤、輪蟲、低等藻類及湖鱭幼魚等，高達30多種。一般體長小于13 cm的湖鱭餌料以枝角類、橈足類等浮游動物為主，當其體長超過13 cm時，餌料中會出現一些經濟魚蝦，當其體長增長至17 cm以上時，餌料中經濟魚蝦相對密度急劇上升[21]。Zhang等[22]研究證實，鄱陽湖短頜鱭食性介于濾食性與肉食性之間。本研究中，小規格短頜鱭還能以浮游動物為食，相比大規格的個體在食性上更為豐富，這很可能是導致鄱陽湖小規格短頜鱭腸道菌群多樣性和豐富度比大規格短頜鱭高的重要原因。而青草沙水庫短頜鱭則與之相反，這可能是由于采集分析的大規格短頜鱭樣本存在江海洄游的個體。徐剛春等[4]在研究長江短頜鱭耳石Sr/Ca值變化特征時發現，長江中存在參與江海洄游的短頜鱭個體。江海洄游需經歷咸、淡水復雜的水環境，導致洄游型短頜鱭腸道菌群多樣性和豐富度更高。

3.2 腸道菌群與水環境的關系

董博等[23]研究發現，河口生活的彈涂魚(Periophthalmuscantonensis)腸道微生物群落中同時具有陸生動物、淡水與海水魚類及兩棲動物的典型細菌家族，這與其在水陸過渡咸淡水交界處的生活特征相吻合，其依靠多樣的腸道微生物來應對不同環境。本研究中發現，鄱陽湖小規格短頜鱭的腸道菌群多樣性和豐富度最高，因其樣品采集于鄱陽湖湖口，此處屬鄱陽湖與長江交匯處，來水及水體環境復雜，相較湖區水體微生物群落更為豐富[24-25]。而青草沙水庫采用“避咸取淡”(避東海咸潮取長江淡水)管理模式，經過十多年的運行，青草沙水庫庫內與庫外的水質發生了明顯差異，庫內為較優質的、穩定的飲用水源[26]，庫內藻類較來水有所增殖，導致庫內微生物多樣性比來水低，即長江水進入水庫后，微生物群落出現了生態演替，菌群多樣性降低[27]，進而影響到棲息于此的魚類腸道菌群多樣性和組成。

3.3 腸道菌群組成及其功能預測

本研究中，從不同水域短頜鱭腸道菌群組成分析可以看出，青草沙水庫和鄱陽湖短頜鱭的腸道菌群中，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門均占絕對優勢。這與鄱陽湖水體環境優勢菌群組成相一致[24-25]，進一步證實水環境是影響短頜鱭腸道菌群多樣性和組成的重要因素。同時也有研究發現，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門這3類細菌在很多魚類腸道中出現且占腸道菌群的90%以上[28]，變形菌門和擬桿菌門的有些成員可以改善宿主的代謝和免疫功能障礙，誘導其免疫應答，很可能與魚的生長和免疫有關[29-30]，這與本研究發現的短頜鱭腸道菌群中，參與生物合成的代謝途徑豐度相較其他代謝通路豐度較高的結果相一致。而厚壁菌門中的某些細菌在魚類的消化吸收過程中提供多種酶[31]，可能在促進短頜鱭營養物質的吸收中發揮重要作用。

4 結論

1)青草沙水庫大規格短頜鱭的腸道菌群多樣性比鄱陽湖同規格短頜鱭的高，而鄱陽湖小規格短頜鱭的腸道菌群多樣性比青草沙水庫同規格的高。

2)不同水域短頜鱭腸道中，每個門類的細菌豐度差異較大；在屬水平上，伯克霍爾德菌屬為豐度差異性最大的菌群。

3)不同水域短頜鱭腸道菌群多樣性和豐度的差異，極有可能是短頜鱭生活史、食性轉變及水環境差異造成的。