鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫對菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體代謝的影響

周紅，谷晶，朱弦一，郭悅，楊國軍，霍忠明，王華

(大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬于軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Lamellibranchia)簾蛤目(Veneroida)簾蛤科(Veneridae)蛤仔屬(Ruditapes)，是中國主要的海水養殖經濟貝類之一[1]。鹽度是影響菲律賓蛤仔存活和生長的重要環境因子之一[2]。研究發現，在低鹽度海水中，菲律賓蛤仔會表現出明顯的應激反應[3]，其攝食率和清濾率均有所下降[4]，當鹽度低于15時，菲律賓蛤仔無法維持其正常的代謝活動[5]。鹽度驟降對菲律賓蛤仔的鰓和肝胰腺影響較明顯[6]，且高溫時海水鹽度波動更容易引起菲律賓蛤仔滲透壓的改變[7]。

亞硝酸鹽氮是養殖水體中常見的污染物之一，水中較高濃度的亞硝酸鹽氮會影響水產養殖動物血液對氧氣的輸送，降低其抵抗環境脅迫的能力，從而抑制其生長發育。研究表明：亞硝酸鹽氮質量濃度增加會引起凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)能量代謝進程加快[8]，急性脅迫時凡納濱對蝦死亡率隨亞硝酸鹽氮濃度的增加而升高[9]；亞硝酸鹽氮對管角螺(Hemifusustuba)稚貝的毒害作用隨pH和鹽度的降低而增大[10]；亞硝酸鹽氮脅迫也會造成菲律賓蛤仔免疫功能下降和組織再生障礙[11]，且對菲律賓蛤仔浮游幼蟲生長發育的影響大于幼貝[12]。然而，有關低鹽度和亞硝酸鹽氮協同作用對水生生物呼吸代謝的影響研究鮮見報道，尤其對貝類呼吸代謝的協同作用未見報道。

菲律賓蛤仔養殖過程中，天然降水可能導致養殖區海水鹽度下降，而含氮有機物的硝化過程受到抑制，可能會導致水中亞硝酸鹽氮積累，海水鹽度下降和亞硝酸鹽氮積累均會影響菲律賓蛤仔的代謝和生長。但是，低鹽度和亞硝酸鹽氮協同脅迫對菲律賓蛤仔呼吸和代謝的影響尚未見報道。本研究中，選取菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體為試驗對象，研究了低鹽度和亞硝酸鹽氮單因子脅迫及二者協同脅迫對菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響，并觀察了協同脅迫后菲律賓蛤仔鰓絲的組織結構變化，以期為探討外界環境脅迫對菲律賓蛤仔代謝的影響提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菲律賓蛤仔(以下簡稱“蛤仔”)“斑馬蛤2號”和莆田群體，均采自遼寧省大連市獐子島貝類育苗基地，“斑馬蛤2號”殼長為(27.5±1.2)mm，莆田群體殼長為(31.2±1.8)mm。正式試驗前將蛤仔暫養7 d，每天全量換水一次，早晚各投喂適量小球藻藻膏(盤錦光合蟹業有限公司生產)一次，正式試驗開始前1 d停止投喂。

試驗用海水取自大連市黑石礁近岸海域，經沉淀、沙濾和紫外消毒后備用，海水鹽度為29.6±0.5，pH為8.0±0.1。試驗在遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心進行。

1.2 方法

蛤仔的耗氧率和排氨率試驗采用密閉靜水方法，試驗水溫為20 ℃，以鹽度30的海水為對照，調整試驗海水鹽度分別為25、20、15，亞硝酸鹽氮質量濃度分別為0、0.15、0.30、0.60 mg/L，分別進行低鹽度、亞硝酸鹽氮單因子脅迫試驗及二者的協同脅迫試驗。每個試驗用海水2 L，放入試驗蛤仔5枚，每個試驗設置3個平行，試驗時間為4 h。試驗前后采用碘量法和次溴酸鹽氧化法(GB 17378.4—2007)分別測定水中溶解氧和總氨氮含量，取蛤仔體軟體部于70 ℃烘箱中干燥24 h后稱重。呼吸代謝過程中的耗氧率、排氨率和氧氮比(O∶N)計算公式分別為

RO=(CD0-CDt)×V/(m×t)。

(1)

RN=(CNt-CN0)×V/(m×t)。

(2)

RO∶N=(RO/16)/(RN/14)。

(3)

式中：RO為耗氧率[mg/(g·h)]；RN為排氨率[mg/(g·h)]；RO∶N為氧氮比；CD0和CDt分別為試驗前和試驗t時水中的溶解氧含量(mg/L)；CN0和CNt分別為試驗前和試驗t時水中的總氨氮質量濃度(mg/L)；V為試驗用海水體積(L)；m為菲律賓蛤仔質量(g)；t為試驗時間(h)。

試驗結束后，從每個試驗組分別取3枚蛤仔，解剖取其鰓，用多聚甲醛固定液固定24 h，用體積分數為70%的乙醇洗滌3次，再進行梯度脫水處理，然后透蠟、包埋、修蠟、切片(切片厚度為5 μm)、展片、脫蠟、染色(蘇木精-伊紅染色法)和脫水，用中性樹膠進行封片，最后在顯微鏡(LEICA DM 4000B LED)下觀察并拍照。

1.3 數據處理

試驗數據均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 26.0軟件進行單因素和雙因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 低鹽度對菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

從圖1可見：在鹽度30、25、20、15范圍內，“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率均隨鹽度的降低而升高，當鹽度降至20、15時，兩種蛤仔的耗氧率均顯著高于對照組(鹽度30)(P<0.05)；“斑馬蛤2號”和莆田群體的排氨率均隨鹽度的降低呈先降低后升高的變化趨勢，與對照組相比，“斑馬蛤2號”的排氨率在低鹽度(25～15)時均顯著降低(P<0.05)，莆田群體的排氨率在鹽度為25、15時顯著降低(P<0.05)，在鹽度為20時又升高且顯著高于其他鹽度組(P<0.05)。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Different letter means significant difference (P<0.05)，and same letter means no significant difference (P>0.05)，et sequentia.圖1 鹽度對“斑馬蛤2號”和莆田群體耗氧率和排氨率的影響Fig.1 Effects of salinity on the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of “Zebra 2” and Putian population

從表1可見：“斑馬蛤2號”的O∶N值隨鹽度的降低呈先升高后降低的趨勢，在低鹽度(25～15)時，其O∶N值均顯著高于對照組(P<0.05)，且在鹽度20時最高；莆田群體在低鹽度(25～15)時，其O∶N值均高于對照組，僅鹽度為15時顯著高于對照組(P<0.05)。

表1 鹽度對“斑馬蛤2號”和莆田群體O∶N值的影響

2.2 亞硝酸鹽氮對菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

從圖2可見：在亞硝酸鹽氮質量濃度為0.15～0.60 mg/L范圍內，“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率隨亞硝酸鹽氮質量濃度的增加而升高，均較對照組顯著升高(P<0.05)，二者的耗氧率均在亞硝酸鹽氮質量濃度為0.60 mg/L時最高，分別為(2.225±0.007)、(2.442±0.005)mg/(g·h)；“斑馬蛤2號”的排氨率呈先降低后升高的趨勢，且在亞硝酸鹽氮質量濃度為0.15～0.60 mg/L時其排氨率均顯著低于對照組(P<0.05)，亞硝酸鹽氮質量濃度為0.15 mg/L時排氨率降至最低，為(0.052±0.006)mg/(g·h)，而莆田群體的排氨率則隨亞硝酸鹽氮質量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，在亞硝酸鹽氮質量濃度為0.30 mg/L時達到最高，為(0.077±0.003)mg/(g·h)。

圖2 亞硝酸鹽氮對“斑馬蛤2號”和莆田群體耗氧率和排氨率的影響Fig.2 Effects of nitrite nitrogen concentration on the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of “Zebra 2” and Putian population

從表2可見：隨亞硝酸鹽氮質量濃度的增加，“斑馬蛤2號”的O∶N值呈先升高后降低的趨勢，而莆田群體O∶N值則呈升高的趨勢；在亞硝酸鹽氮質量濃度為0.15～0.60 mg/L時，兩種蛤仔的O∶N值均顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 亞硝酸鹽氮對“斑馬蛤2號”和莆田群體O∶N值的影響

2.3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協同對菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

通過雙因素方差分析顯示，低鹽度和亞硝酸鹽氮協同作用對菲律賓蛤仔的耗氧率和排氨率有顯著性影響(P=0.04)。

從圖3可見，總體上，“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率在同一鹽度下均隨亞硝酸鹽氮質量濃度的增加而升高，均在鹽度15和亞硝酸鹽氮質量濃度0.60 mg/L協同脅迫下最高，分別為(2.458±0.033)、(2.583±0.012)mg/(g·h)，表明低鹽度和高質量濃度亞硝酸鹽氮協同脅迫對蛤仔耗氧率的影響更顯著。從圖4可見，“斑馬蛤2號”排氨率在鹽度15和亞硝酸鹽氮質量濃度0.30 mg/L協同脅迫下最高，為(0.162±0.007)mg/(g·h)，莆田群體排氨率在鹽度為15和亞硝酸鹽氮質量濃度為0.60 mg/L協同脅迫時最高，為(0.161±0.007)mg/(g·h)。

標有不同大寫字母表示“斑馬蛤2號”在同一鹽度下不同亞硝酸鹽氮質量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同小寫字母表示莆田群體在同一鹽度下不同亞硝酸鹽氮質量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Different capital letters indicate that “Zebra 2” has significant differences among groups with different nitrite nitrogen concentrations under the same salinity (P<0.05)；different letters indicate that Putian population has significant differences among groups with different nitrite nitrogen concentrations under the same salinity (P<0.05)；and the means with the same letters are not significant differences(P>0.05)，et sequentia.圖3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協同對菲律賓蛤仔耗氧率的影響Fig.3 Synergistic effect of low salinity and nitrite nitrogen on the oxygen consumption of Ruditapes philippinrum

圖4 低鹽度和亞硝酸鹽氮協同對菲律賓蛤仔排氨率的影響Fig.4 Synergistic effect of low salinity and nitrite nitrogen on the ammonia excretion rate of Ruditapes philippinarum

從表3可見：“斑馬蛤2號”和莆田群體的O∶N值總體上隨鹽度的降低和亞硝酸鹽氮質量濃度的增加呈升高趨勢，對照組O∶N值均較低；“斑馬蛤2號”O∶N值在鹽度為30和亞硝酸鹽氮質量濃度為0.15 mg/L協同脅迫時最高，莆田群體O∶N值在鹽度為30和亞硝酸鹽氮質量濃度為0.60 mg/L協同脅迫時最高。

表3 鹽度和亞硝酸鹽氮協同對菲律賓蛤仔O∶N值的影響

2.4 低鹽度和亞硝酸鹽氮協同對菲律賓蛤仔鰓組織結構的影響

經低鹽度和亞硝酸鹽氮協同脅迫4 h后，對蛤仔的鰓組織結構觀察發現：蛤仔對照組的鰓組織結構完整、呼吸上皮細胞排列整齊、細胞結構形態結構正常(圖5A)；在鹽度15和亞硝酸鹽氮質量濃度為0.60 mg/L協同脅迫下，“斑馬蛤2號”的鰓絲出現呼吸上皮細胞脫落、鰓小片上皮細胞排列發生紊亂和鰓小片輕微腫脹(圖5B)，莆田群體鰓絲出現了皺縮、呼吸上皮細胞脫落和鰓間距增大(圖5C)。

A—對照組；B—“斑馬蛤2號”；C—莆田群體。A—control group；B—“Zebra 2”；C—Putian population.圖5 低鹽度(鹽度15)和亞硝酸鹽氮(0.60 mg/L)協同對菲律賓蛤仔鰓組織結構的影響Fig.5 Synergistic effect of low salinity(salinity 15)and nitrite nitrogen(0.60 mg/L)on the gill tissue structure of Ruditapes philippinarum

3 討論

3.1 低鹽度對菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響

鹽度對貝類的呼吸和代謝作用具有重要影響，也是決定海洋貝類生態分布的重要因子之一。河流入?？诟浇蜓匕逗Ｓ?，因降雨、蒸發和河流流量等因素會影響該區域的鹽度。鹽度變化不僅影響貝類的攝食能力，還會影響其呼吸作用。鹽度過高或過低均會使貝類關閉進出水管，緊閉雙殼，形成組織隔離和外部環境隔離，導致呼吸作用和代謝過程減慢[13]。鹽度變化會影響貝類的耗氧率和排氨率，王剛等[14]研究發現，近江牡蠣(Crassostreahongkongensis)在低鹽度時耗氧率增加，而Navarro等[15]卻發現，殼菜蛤(Choromytiluschorus)的耗氧率隨鹽度的降低而降低。丁天揚等[16]研究發現，文蛤(Meretrixmeretrix)的耗氧率隨鹽度的降低而升高，本研究結果與此相似，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率均隨鹽度的降低而升高，這可能與菲律賓蛤仔通過消耗自身能量來調節滲透壓有關，菲律賓蛤仔生存在等滲點海水環境中時，用于維持自身生理活動的能量消耗較少，反之則需要較多的能量來適應鹽度的變化。上述研究表明，低鹽度脅迫對不同海水養殖動物的呼吸代謝影響不同。

O∶N是動物利用能源物質的一個重要指標之一，代表動物體內蛋白質與脂肪、糖類分解代謝的比率[17]。動物體內當蛋白質代謝占主導地位時，O∶N值通常較低。如果機體消耗的能量完全由蛋白質提供，O∶N值約為7；當7

3.2 亞硝酸鹽氮對菲律賓蛤仔耗氧率的影響

亞硝酸鹽氮是水產養殖中的常見污染物，在養殖環境中積累過量會降低養殖生物血液輸送氧氣的能力[21]。本研究中，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率隨水中亞硝酸鹽質量濃度的增加而升高，這可能是因為亞硝酸鹽氮對菲律賓蛤仔產生脅迫作用，菲律賓蛤仔需要更多的能量來響應亞硝酸鹽氮的脅迫，導致菲律賓蛤仔耗氧率增加。這說明水中高濃度的亞硝酸鹽氮會對養殖生物的呼吸代謝造成嚴重影響。

3.3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協同脅迫對菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響

水環境因子變化影響貝類的呼吸代謝，亞硝酸鹽氮和鹽度是養殖水體中重要的環境因子，會影響生物的呼吸代謝功能。本研究中，首次進行了低鹽度和亞硝酸鹽氮協同對貝類呼吸代謝的影響試驗，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體在低鹽度(鹽度15)和高亞硝酸鹽氮(質量濃度0.60 mg/L)單因子及二者協同脅迫下均未出現死亡現象，但其耗氧率和排氨率出現明顯變化，且二者協同脅迫下蛤仔的耗氧率明顯大于單因子脅迫下的耗氧率。出現這種情況的原因，可能是雙因子協同脅迫下，菲律賓蛤仔出現了更加明顯的應激反應，需要消耗更多的溶解氧維持自身代謝需求。此外，通過分析低鹽度和亞硝酸鹽氮協同脅迫下菲律賓蛤仔的O∶N值可以看出，菲律賓蛤仔主要由脂肪或碳水化合物提供能量，表明低鹽度和高亞硝酸鹽氮質量濃度對菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響更大。

菲律賓蛤仔的呼吸器官是鰓，在低鹽度環境中會造成菲律賓蛤仔鰓絲連接松散、褶皺無法形成、纖毛運動停止和呼吸濾食受阻等[6]。本研究中，在低鹽度和亞硝酸鹽氮的協同作用下，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體出現了鰓絲呼吸上皮細胞脫落、鰓小片輕微腫脹、鰓小片上皮細胞排列發生紊亂和部分鰓絲出現皺縮等，說明低鹽度和亞硝酸鹽氮協同脅迫會對菲律賓蛤仔的呼吸器官產生不利影響。Galat等[22]研究發現，低鹽度脅迫會使鮭(Salmoclarki)鰓上皮裂解、泌氯細胞增生。Stewart Fielder等[23]研究發現鹽度脅迫會影響金頭鯛(Pagrusauratus)鰓絲上泌氯細胞的數目和形態變化。宮春光等[24]發現，亞硝酸鹽氮急性脅迫會造成斑尾復蝦虎魚(Synechogobiushasta)組織結構損傷，使其鰓絲充血，鰓小片上皮細胞增生等。上述研究均表明，鹽度和亞硝酸鹽氮會對水產動物的呼吸器官產生影響。

4 結論

1)低鹽度和亞硝酸鹽氮單因子均會對菲律賓蛤仔產生脅迫作用，兩者協同對菲律賓蛤仔的脅迫作用大于單因子脅迫，且低鹽度和高濃度亞硝酸鹽氮協同脅迫對菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”和莆田群體的耗氧率和排氨率的影響較大。

2)低鹽度和亞硝酸鹽氮協同造成菲律賓蛤仔鰓絲連接松散，說明低鹽度和亞硝酸鹽氮協同作用會對菲律賓蛤仔的呼吸器官產生不利影響。