激活嘌呤回補途徑提高淀粉酶產色鏈霉菌豐加霉素產量

張子軒，宋 陽，申屠旭萍，俞曉平

（中國計量大學生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州 310018）

豐加霉素（Toyocamycin，TM）是鏈霉菌的次生代謝產物，作為核苷類抗生素家族中重要成員之一，具有高效性、低毒性和低殘留的特性，在農業植物真菌病害的生物防治中具有廣闊的應用前景。1970年，Suhadolnik 利用同位素14C 和3H 喂養試驗發現了一種新型的核糖類抗生素，其核糖C1 連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環，分子式為C12H13N5O4，命名為豐加霉素[1]。由于其對動物病原菌如白假絲酵母Candidaalbicans，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的生長有強烈的抑制作用，其生物活性研究報道主要集中在抗病原菌方面[2]。近期有研究發現，TM 對多種植物疫病具有良好的防治效果。豐加霉素由淀粉酶產色鏈霉菌發酵產生，對水稻紋枯病菌、葡萄炭疽病菌和番茄灰霉病菌等7 種植物病原真菌具有良好的抑制作用[3]，也能夠抑制稻瘟致病菌孢子的萌發和菌絲的生長[4]。因此，豐加霉素在農業植物病害生物防治領域具有巨大的應用潛力，豐加霉素作為生防菌株淀粉酶產色鏈霉菌的次級代謝產物，對環境更加友好[3]。

鏈霉菌屬Streptomyces是一種廣泛分布于土壤、海洋、極端條件等環境中的高等放線菌。鏈霉菌所能產生的天然次級代謝產物是世界上70%抗生素的來源。淀粉酶產色鏈霉菌S.diastatochromogenes1628 最初是2006 年從土壤樣本中分離出來，經進一步提取分離研究表明，菌株1628 能產生多種次生代謝產物，包括豐加霉素和四烯大環內酯類化合物（四霉素A、四霉素P 和四環素B）[5]。由于豐加霉素在生防領域的效果顯著，未來有可能應用于植物病害防治，本研究將有助于推動豐加霉素的產業化生產。鏈霉菌的次級代謝產物受到菌體內多層次調控因子的調節作用，常規的結構基因過量表達通常無法大量提高目標代謝產物產量，因此需要對鏈霉菌次級代謝產物的合成途徑進行分析。前期研究發現合成TM 的前體物質為GTP，而GTP 通常由嘌呤合成途徑和嘌呤回補途徑維持GTP 的穩態[6,7]。嘌呤合成途徑為利用5-磷酸核糖（Ribose-5-P）通過核糖磷酸焦磷酸激酶（Ribose-phosphate pyrophosphokinase，Rpp）催化合成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），PRPP 在嘌呤操縱子作用下經過次黃嘌呤（HPX）合成肌苷酸（IMP）（從HPX 到IMP 由HprT 催化），IMP 在GuaB、GuaA 催化下合成GMP，GMP 在Gmk 催化下合成GDP，GDP 在Ndk酶催化下磷酸化形成GTP[8]（圖1）。前期研究表明，過量表達GTP 合成途徑中的rpp基因能夠提高胞內GTP 含量122%，豐加霉素產量提高133.3%，產量達到340.2 mg/L[9]。但由于在生長穩定期存在嚴謹反應抑制GTP 合成途徑以及激活嘌呤回補途徑的作用。因此，本研究從維持嘌呤穩態的嘌呤回補途徑入手，提高TM 產量。

圖1 GTP 合成途徑與回補途徑Fig.1 The synthesis and salvage pathway of GTP

嘌呤回補途徑（purine salvage pathway）指的是菌體利用外源或者內源細胞更新產生的嘌呤（堿基或核苷）轉化為核苷酸，核苷被轉化為堿基[10]。例如，外源鳥苷被降解為鳥嘌呤，鳥嘌呤通過（也可以不通過）黃嘌呤途徑合成GMP。外源或內源代謝產生的腺苷通過腺嘌呤或者肌苷合成次黃嘌呤，次黃嘌呤HPX合成肌苷酸IMP，兩條途徑均可以實現嘌呤回補[8]（圖1）。而對于黃嘌呤與次黃嘌呤之間的轉變過程，受到黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，xdh）基因簇的催化。因此，xdh基因簇是實現嘌呤回補途徑的重要環節，也是合成GTP，維持細胞內GTP 穩態的重要步驟。xdh基因簇由3 個基因（xdhA、xdhB、xdhC）組成，共同受到XdhR 蛋白的阻遏調節，在嚴謹反應發生時，較高濃度的ppGpp 與XdhR 基因結合，激活嘌呤回補途徑[8]。另一方面，有研究表明，XdhR 也是次級代謝基因簇表達的抑制性調控因子，能夠結合到次級代謝基因簇的啟動子區，調節次級代謝產物合成[11]。但是xdhR基因在淀粉酶產色鏈霉菌中的基因功能尚未明確，需要通過敲除xdhR基因來研究xdhR 對豐加霉素合成的影響。

本研究旨在闡明xdhR基因的序列特征、在淀粉酶產色鏈霉菌1628 中對于形態分化的影響，以及xdhR基因與TM 生物合成中的相關性。同時，也考察敲除xdhR基因后對嘌呤合成途徑基因轉錄、胞內GTP 含量的影響，進一步揭示xdhR基因對豐加霉素合成的重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 研究所用的淀粉酶產色鏈霉菌S.diastatochromogenes1628 菌株是由浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室提供。大腸桿菌E.coliJM109，質粒pKC1139 是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，用于構建敲除突變株（均由本實驗室保存）。

1.1.2 培養基 LB 培養基：10 g 蛋白胨，10 g NaCl，5 g 酵母提取物，1 L 超純水，pH 調至7.4；葡萄糖酵母礦物質（Glucose yeast extract mineral，GYM）培養基：10 g 麥芽提取物，4 g 葡萄糖，4 g 酵母提取物，2 g NaCl，1 g 酶解酪蛋白，600 μL OB 溶液（5 g CuSO4·5H2O，7.5 g FeSO4·7H2O，5 g MgSO4·7H2O，3.6 g MnSO4·7H2O，9 g ZnSO4·7H2O，35 g CuCl2·2H2O，1 L 超純水），1 L 超純水，pH 調至7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂，1 L 超純水，pH 調至7.0；MS 培養基：20 g 黃豆粉，20 g 甘露醇，18 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH 調至7.4。

1.1.3 引物 本試驗所用引物如表1 所示

表1 本試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產色鏈霉菌1628 RNA 的提取 挑取菌株1628 培養平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養2 d，搖勻菌液，以2%接種量接至新液體GYM 培養基于28 ℃、180 r/min 條件下培養至4 d，每隔24 h 取50 mL 菌液，4 ℃、7000 r/min 離心5 min，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS，20 mmol/L，pH 7.4）清洗菌體2 次，最后棄去PBS 上清，將菌體轉移至無菌濾紙吸凈水分，挑入研缽中使用液氮研磨至粉末狀，RNA 的提取按照TaKaRa 的RNA 提取試劑盒（No.9767）說明書進行操作。

1.2.2xdhR基因的敲除質粒的構建 通過同源重組的方法對xdhR基因進行敲除。以菌株淀粉酶產色鏈霉菌1628 基因組DNA 為模板，通過XdhR Left for/ XdhR Left rev 和XdhR Right for/XdhR Right rev 分別擴增xdhR基因上、下游同源臂并連接在pKC1139 質粒上，構建xdhR基因的敲除質粒。將質粒轉化進大腸桿菌JM109感受態，使用驗證引物-for/rev 進行菌落PCR 驗證，將顯示陽性結果對應菌落進行擴培，提取質粒酶切驗證，測序驗證成功后為載體pKC1139-ΔXdhR。

1.2.3 敲除xdhR基因的菌株構建 用熱激的方法將 pKC1139-ΔXdhR轉入E.coliET12567（pUZ8002）獲得結合轉移供體菌株E.coliET12567（pUZ8002/ΔXdhR），并通過對轉化子進行質粒提取、酶切驗證確認供體菌正確。隨后在MS 平板上培養野生型菌株1628，收集孢子后，與大腸桿菌ET12567（pUZ8002/ΔXdhR）混合，通過接合轉移的方法將敲除質粒整合到菌株1628 基因組中，在含有安普霉素的MS 平板上覆蓋萘啶酮酸篩選轉化子。挑取轉化子轉接至含有安普霉素的平板上，28 ℃培養7 d，制備孢子懸液。經適當稀釋后，以每個平皿 104個孢子的濃度涂布在不含抗生素的GYM 培養基上42℃高溫培養。隨后挑取單菌落在無抗性GYM 培養基上28 ℃松弛培養，將生長出來的菌落同時影印到GYM（Ap）和無抗GYM 培養基上，篩選發生雙交換（ApS）的xdhR基因阻斷突變株。隨機選擇10 株xdhR基因阻斷突變株接種于無任何選擇壓力的基本培養基上，28 ℃下培養，驗證其穩定性。并采用XdhR Left for/ XdhR Right rev 引物驗證xdhR基因敲除成功。

1.2.4 菌株發酵及豐加霉素產量測定方法 分別挑取淀粉酶產色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR培養平板的單菌落接種至液體GYM 培養基于28 ℃、180 r/min 條件下培養2 d，以2%的接種量轉接至液體GYM培養基于28 ℃、180 r/min 條件下培養10 d。每隔24 h 取1 mL 發酵液11000 r/min 離心10 min，取上清，使用0.22 μm 的微孔濾膜過濾于1.5 mL 的液相瓶中備用，采用HPLC 方法分析豐加霉素含量[12]。

流動相A 為超純水，流動相B 為色譜甲醇，用孔徑0.45 μm 的偏氟膜過濾色譜甲醇，用孔徑0.45 μm 的纖維膜過濾超純水，過濾后將流動相瓶放置于超聲波清洗儀中超聲30 min，去除氣泡。色譜柱為C18 色譜柱，柱溫設置為30 ℃。洗脫方法見表2。

表2 HPLC 條件Table 2 HPLC conditions

1.2.5 SEM 電鏡分析 挑取鏈霉菌培養平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養2 d，用槍頭吸取菌絲體置于1.5 mL 離心管內吸取量保證離心后沉淀于管底約為黃豆大小，室溫、2000 r/min 離心，棄掉上清。用PBS 洗菌體1～2 次，棄掉上清，沿管壁緩慢加入4℃預冷的電鏡固定液，放置于4 ℃保存，固定12 h 以上寄送樣品送公司進行SEM 電鏡拍照。

1.2.6 RT-qPCR 方法 以S.diastatochromogenes1628 的gyrB基因作為內參基因，以豐加霉素生物合成關鍵基toyB、toyC、toyD、toyE、toyF、toyG、toyI、toyM和嘌呤合成途徑關鍵基因guaA，gmK，ndk為目的基因分別設計熒光定量PCR 引物。分別收集淀粉酶產色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR培養4 d 的菌體，提取總RNA 取1 μg 反轉錄，以反轉錄后的cDNA 為模板，進行熒光定量PCR 分析。熒光定量PCR程序設置如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40 個循環。每個基因做3 個重復，使用TaKaRa熒光定量PCR 試劑盒（No.RR071A）配制反應體系。

1.2.7 GTP 含量測定方法 挑取鏈霉菌培養平板上單菌落（5 mm 直徑）接種至液體GYM 培養基，于28 ℃、180 r/min 條件下培養2 d，以2%接種量接至新液體GYM 培養基于28 ℃、180 r/min 條件下培養至所需生長期，取50 mL 菌液，4 ℃、7000 r/min 離心5 min，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗菌體2 次后液氮研磨至粉末狀，將破碎后的菌體100 mg 浸泡在3 mL 2 mol/L 甲酸中，并在冰水中孵育30 min。將醋酸銨（50 mol/L，pH 4.5）加入到粉碎的組織中至體積為6 mL，并在4 ℃、5000 r/min 離心5 min 后收集上清液。

固相萃?。⊿PE）過程根據文獻[13]進行，用1 mL 甲醇和1 mL 50 mmol/L 醋酸銨（pH 4.5）對SPE 柱進行預處理后，將上述樣品溶液裝載到SPE 柱上。用1 mL 50 mmol/L 醋酸銨（pH 4.5）清洗SPE 柱，用1 mL 甲醇洗滌SPE 柱，用1 mL MeOH:H2O:NH4OH（20:70:10）溶液從SPE 柱上洗脫核苷酸。4 ℃冷凍干燥后，溶解于200 μL 水中，使用0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，采用文獻中相同的方法[13]利用LC-MS 法測定GTP 含量。

1.2.8 抑菌活性測定 將鏈霉菌接種于GYM 培養基中28 ℃、180 r/min 培養4 d，離心收集上清發酵液將發酵液稀釋6 個梯度（稀釋后發酵上清液濃度分別為0%，20%，40%，60%，80%，100%），后取100 μL涂布于PDA 培養基上。將水稻紋枯和黃瓜枯萎病菌接種于PDA 培養基中于28 ℃培養箱中培養2 d，分別利用打孔器獲得5 mm 菌片，將菌片放置于涂布有不同濃度發酵液的PDA 培養平皿中心，每組設置3 組平行重復，取平均值計算抑制率，對照組為無菌水處理。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

2 結果與分析

2.1 序列對比和進化樹分析

在淀粉酶產色鏈霉菌中，xdhA、xdhB、xdhC基因在基因組中順序排列，受到位于上游的XdhR 調控因子的調控作用。xdhA編碼一個2Fe-2S 的結構域、xdhB編碼一個FAD 結合結構域，xdhC編碼一個鉬結合結構域，這三個結構域共同組成一個含鉬氧化還原酶[8]。在xdhR與xdhA的起始密碼子中間，存在兩個方向的啟動子，也存在著XdhR 蛋白的結合序列。同時，通過序列比對發現，這段基因間序列存在2 個不完美的回文序列，與天藍色鏈霉菌內的xdh基因簇的基因排布一致，并且存在重疊的-35 區，這些位點可能是XdhR 的結合位點。

通過進化樹分析發現，淀粉酶產色鏈霉菌xdhR序列與來自蟻鏈霉菌Streptomycesformicae菌株的xdhR氨基酸比較相近，與唐德鏈霉菌Streptomycestendae菌株的xdhR氨基酸序列相似度較低。與模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyceslividans的序列相似度為61.9%，因此，淀粉酶產色鏈霉菌的xdhR基因具有與S.lividans中xdhR相似功能（圖2）。

圖2 xdhR 基因的進化樹分析及序列分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis and sequence analysis of xdhR gene

隨后，對XdhR 的結構功能進行分析。XdhR 是TetR 家族的調控因子，該家族的調控因子具有保守的helix-turn-helix 結構域，用于結合DNA 分子。在TetR 家族的轉錄調控因子的C 端或者N 端，通常是各種各樣的配體結合結構域，用于響應不同的配體分子。盡管TetR 家族的分子并沒有特定的保守序列，但是通過Swiss-model 構建出的淀粉酶產色鏈霉菌XdhR 的三維立體結構表明（以2rek 為模板），結構上XdhR屬于? 型，符合TetR 家族轉錄調控因子的結構特征[14]。說明該TetR 家族的調節分子可能通過與配體結合后的變構作用實現DNA 結合的功能。目前已知的XdhR 的配體為嚴謹反應信號分子ppGpp，因此，在ppGpp激活次級代謝基因轉錄時，會激活xdh基因簇的表達，進而激活嘌呤回補途徑。

2.2 重組菌1628_ΔXdhR 的構建及驗證

采用同源雙交換方法進行無縫基因敲除，連接敲除基因上下游同源臂于pKC1139 載體上構建成敲除載體pKC1139-ΔXdhR，通過結合轉移方法將載體轉入淀粉酶產色鏈霉菌1628 中，隨后通過高溫誘導獲得單交換突變株，松弛培養后篩選出同時在無抗GYM 培養基上生長而不在GYM（Ap）培養基上生長的同一菌落，隨機選擇10 株xdhR基因阻斷突變株接種于無任何選擇壓力的基本培養基上，28 ℃下擴大培養測定其遺傳穩定性。用引物XdhR Left for/ XdhR Right rev 進行驗證，敲除成功后的結果長度為4074bp（圖3），并通過基因測序確認敲除基因正確。重組菌1628_ΔXdhR構建成功。

圖3 1628_ΔXdhR 突變菌株的PCR 驗證Fig.3 PCR result of recombinant 1628_ΔXdhR deletion mutant

2.3 激活嘌呤回補途徑對豐加霉素產量的影響

調控因子XdhR 是嘌呤回補途徑基因xdhA、xdhB、xdhC的轉錄抑制因子，所以敲除xdhR基因對于激活嘌呤回補途徑具有重要作用。本研究中采用同源重組的方式構建xdhR基因的敲除菌株，測定重組菌1628_ΔxdhR菌株與淀粉酶產色鏈霉菌1628 菌株的豐加霉素產量。結果發現，發酵至 96 h 時，重組菌1628_ΔxdhR中豐加霉素產量達到最高 287.8 mg/L，較淀粉酶產色鏈霉菌1628 升高114.0%。該結果表明敲除基因xdhR對豐加霉素合成起促進作用（圖4）。

圖4 淀粉酶產色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 的豐加霉素產素水平比較Fig.4 Comparison of toyocamycin production between amylase-producing S.diastatochromogenes 1628 and 1628_ΔXdhR

2.4 重組菌1628_ΔXdhR 和淀粉酶產色鏈霉菌1628 的菌落形態

通常，鏈霉菌的菌絲分化和形態學變化與次級代謝產物積累密切相關。淀粉酶產色鏈霉菌1628 的菌落呈白色正圓形（圖5a），中央隆起，表面弧度較為圓潤，菌絲表面較為平整光滑。重組菌1628_ΔxdhR（圖5c）菌落較1628 原始菌菌更加粗糙。在SEM 電鏡照片中，淀粉酶產色鏈霉菌1628（圖5b）菌絲較為光滑稀疏，重組菌1628_ΔxdhR（圖5d）菌絲較淀粉酶產色鏈霉菌1628 菌絲更加密一些，也附有更多一些絮狀物質。說明嘌呤代謝途徑變化，導致鏈霉菌菌絲形態發生變化。

圖5 淀粉酶產色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 菌落形態和電鏡照片Fig.5 Colony morphology and electron microscopic photos of S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR

2.5 敲除xdhR 基因對豐加霉素合成途徑基因轉錄水平的影響

豐加霉素由豐加霉素合成基因簇合成，該基因簇主要受到全局調控因子adpA和途徑特異性調控因子toyA的調控作用，toyB、toyC、toyD、toyE、toyF、toyG、toyI、toyM是合成豐加霉素的途徑基因。因此，通過分析重組菌1628_ΔXdhR菌株與淀粉酶產色鏈霉菌1628 的toy基因表達水平差異，可以解釋豐加霉素產量變化的原因。通過對重組菌1628_ΔXdhR菌株和淀粉酶產色鏈霉菌1628 在第四天進行轉錄水平分析發現，adpA的轉錄水平提高4.27 倍，說明XdhR 作為轉錄調控因子影響adpA基因的轉錄。而toy基因簇的途徑特異性調控因子toyA的轉錄水平提升1.47 倍，能夠激活toy基因簇結構基因的表達。在結構基因中，toyB、toyD、toyE的基因轉錄水平激活幅度較大，達到2.54 倍以上。而其他結構基因的轉錄水平激活在1.15～1.74 之間（圖6）。

圖6 淀粉酶產色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 的豐加霉素合成途徑基因轉錄水平Fig.6 Gene transcription level of toyocamycin biosynthesis pathway in S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628 _ΔXdhR

2.6 敲除xdhR 基因對嘌呤合成途徑及嘌呤回補途徑基因表達的影響

重組菌1628_ΔxdhR菌株中嘌呤合成途徑基因guaA、gmK、ndk的轉錄水平變化，以及嘌呤回補途徑基因xdhA、xdhB、xdhC基因的轉錄水平變化，表明1628_ΔxdhR對嘌呤代謝的總體影響。通過測定guaA,gmK和ndk基因的轉錄水平發現，敲除xdhR微弱的抑制嘌呤合成途徑基因，guaA、gmK和ndk的轉錄水平分別降低12.9%、14.8%和24.4%（圖7A）。通過測定嘌呤回補途徑基因xdhA、xdhB和xdhC基因的表達水平發現敲除xdhR激活嘌呤回補途徑幅度較大，xdhA、xdhB和xdhC的轉錄水平提升154.4%、56.9%和102.7%（圖7A）。隨后測定胞內GTP 含量來表征胞內GTP 水平的變化發現，24～96 h 敲除菌的胞內GTP 含量與野生菌株相比略有提升，但4 d 內的GTP 含量不存在顯著差異，說明敲除xdhR基因仍然能夠保持鏈霉菌內的GTP 穩態（圖7B）。

圖7 淀粉酶產色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 對嘌呤合成和回補途徑的影響Fig.7 The effect of xdhR gene on the purine biosynthesis and salvage pathway in S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR

2.7 重組菌1628_ΔXdhR 對植物病原菌的抑制效果的影響

對照組（淀粉酶產色鏈霉菌1628）與處理組（重組菌1628_ΔXdhR）100%的發酵液對黃瓜枯萎病致病菌菌絲的抑制率分別是48.9%和69.3%（圖8A）。而對于水稻紋枯病致病菌，重組菌1628_ΔXdhR發酵上清液的抑菌效果則更好，淀粉酶產色鏈霉菌1628 和重組菌1628_ΔXdhR100%的發酵液對水稻紋枯病致病菌菌絲的抑制率分別是69.3%和100%（圖8B）。試驗結果表明，淀粉酶產色鏈霉菌重組菌1628_ΔXdhR發酵上清液對植物病原菌的生長相較于淀粉酶產色鏈霉菌1628 有明顯提高。

圖8 不同含量淀粉酶產色鏈霉菌1628 及重組菌1628_ΔXdhR 發酵液對黃瓜枯萎病病菌和水稻紋枯病致病菌菌絲生長的影響Fig.8 Effect of different concentration of fermentation broth of S.diastatochromogenes 1628 and recombinant 1628_ΔXdhR on mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum and Rhizoctonia solani

3 討論

TetR 家族蛋白參與細胞的各種功能，包括多藥耐藥、抗生素的生物合成、建立致病性和調控代謝途徑[15,16]。它們通常作為阻遏物發揮作用，通過與特定配體結合到特定基因前調控基因表達[17,18]。本研究在構建敲除xdhR基因菌株時也觀察到TM 產量的提高，說明xdhR基因對于TM 的產量具有負調控作用。在天藍色鏈霉菌中也有類似現象，在敲除xdhR基因后放線紅素的合成提高2.5 倍[11]。通過電鏡照片對比可知，xdhR基因不僅對于TM 的產量有調控作用，對于菌落形態分化也有著調控作用，使得菌落不再光滑，菌絲變得更密和更粗糙。

XdhR 存在于嘌呤合成與回補途徑中，所以敲除xdhR基因后，導致嘌呤合成與回補途徑基因轉錄水平的變化，其中嘌呤合成途徑基因轉錄水平略有抑制，而嘌呤回補途徑基因xdhA、xdhB和xdhC大量表達，進一步分析胞內GTP 水平發現GTP 含量略有提高，然而，胞內GTP 含量在野生型菌株和xdhR敲除菌株中不具備顯著性差異，說明鏈霉菌中存在其他調控途徑來維持GTP 的穩態。例如，IMP 脫氫酶（IMP dehydrogenase）能夠與ATP、GTP 和ppGpp 結合來改變自身催化活性[19]，發酵后期胞內ppGpp 積累導致GTP 被利用[10]等。同時，GTP 含量的大幅度改變也會導致微生物生長速度減慢甚至死亡[20]。所以對于核苷類抗生素來說，提高其前體供應（如ATP 和GTP 等核苷類底物）仍然是比較困難的任務。另一方面，結合GTP 穩態以及更高的豐加霉素產量來說，XdhR 對豐加霉素的激活機制不是通過提高豐霉素前體GTP供應而激活，而更有可能的是XdhR 直接對豐加霉素合成基因簇轉錄的激活，類似現象在天藍色鏈霉菌M145 中已有發現[11]。

長期以來對于植物病害的防治都很大程度依賴于化學防治，但化學農藥的使用會帶來大量的環境污染和生態破壞等負面影響[21]。生物防治在環境保護和綠色健康方面的優越性很大程度上高于化學防治，因此應用生物防治和生物抗菌已迫在眉睫。豐加霉素作為一種具有巨大應用潛力的農用抗生素，本課題組前期發現豐加霉素可以拮抗黃瓜立枯絲核菌，防止黃瓜立枯病[22]。豐加霉素在其他生防菌株中也發揮抑菌作用，如在抗真菌農藥農抗120 的產生菌S.hygrospinosusvar.beijingensis的次級代謝產物中也鑒定到豐加霉素成分[23]。此外，關于農抗120 的生防研究發現它對自粉病、瓜果和蔬菜炭疽病、西瓜枯萎病以及水稻紋枯病其有顯著的防治效果，同時也有促進植物增產的作用[24]。這些研究表明豐加霉素在植物防治中的重要地位。本研究中通過提高豐加霉素產量大幅度提高淀粉酶產色鏈霉菌的生防效果，也為其他生防菌株改造和提高生防效果提供了可靠的理論依據。