MTHFR C677T、A1298C 與不明原因習慣性流產的相關性研究

趙 丹，祁 琳，劉 銳，易甜甜，汪紅秋，潘 振，謝小芳

(蘇州大學附屬第二醫院精準醫學診斷中心，蘇州 215004)

習慣性流產(habitual abortion,HA)是指在妊娠前20 周內連續發生了3 次或3 次以上的自然流產[1]。全球1%～3%的育齡女性患有此疾病，屬于產科高發疾病。HA 發病涉及因素較多，包括子宮異常、胚胎核型異常、免疫功能紊亂、感染性疾病、內分泌系統疾病、父母遺傳疾病(核型異常、隱性疾病攜帶者、顯性疾病和易栓癥)等[2-3]。與上述因素無關，且通過宮腔鏡，子宮輸卵管造影和抗磷脂抗體檢測仍無法判斷原因的通常稱為不明原因習慣性流產(unexplained habitual abortion,UHA)。目前，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因與UHA 之間是否存在相關性受到了諸多學者的關注。MTHFR 突變易使機體葉酸代謝受阻，降低同型半胱氨酸向蛋氨酸轉化從而引起高同型半胱氨酸血癥，最終誘發胚胎細胞凋亡導致流產；其遺傳多態性已被證實是高同型半胱氨酸的常見遺傳因子[4-5]。MTHFR 基因易發生突變，突變概率與突變位點均具有區域性和種族性[6]。目前，暫未發現蘇州地區有關育齡女性MTHFR 基因多態性分布與UHA 關系的報道，本研究通過檢測患者體內MTHFR 基因C677T以及A1298C 多態性分布，探討其與UHA 發生的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象與分組 將2021 年1 月—2022 年12 月在蘇州大學附屬第二醫院生殖中心就診的104例UHA 患者納入病例組，年齡20～40 歲，平均(29.20±3.40)歲；同期589 名妊娠正常無自然流產史者納入對照組，年齡20～39 歲，平均(28.58±3.31)歲。兩組年齡差異無統計學意義(P＞0.05)。所選受試者的臨床資料完整，排除意識障礙、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、生殖系統感染、夫妻雙方染色體異常者。

1.2 MTHFR 基因多態性檢測方法 選用EDTA 負壓抗凝管，采集受試者靜脈血2 mL。按照柱式提取試劑盒(蘇州康吉診斷有限公司)說明書提取血液樣本DNA。使用葉酸代謝能力測定試劑盒(熒光法)(江西諾德醫療器械有限公司)檢測C677T、A1298C 基因多態性，ABI7900 PCR 分析儀進行擴增分析，PCR反應體系總體積20 μL，擴增程序：95 ℃10 min 激活熒光基團；95 ℃15 s 變性，60 ℃40 s，40 個循環；室溫冷卻1 min。60 ℃收集FAM 和HEX(或VIC)通道信號。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件分析基因分布頻率。Pearson χ2檢驗比較兩組間基因分布頻率，計算OR 值及95%CI；以±s 表示計量資料，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg,H-W)遺傳平衡定律校驗基因多態性，P＞0.05 表示基因型分布符合H-W 定律。

2 結果

2.1 H-W 平衡檢驗 H-W 平衡校驗結果顯示，本研究中MTHFR C677T、A1298C 位點的基因多態性符合該定律(P＞0.05)，見表1，表明所選樣本具有群體代表性。

表1 H-W 平衡檢驗

2.2 MTHFR C677T 基因型及等位基因分布頻率差異 病例組與對照組MTHFR C677T 的3 種基因型分布頻率(CC、CT 和TT)差異有統計學意義(P＜0.05)，病例組TT 基因型頻率及突變T 等位基因頻率均高于對照組(均P＜0.05)，見表2。

表2 MTHFR C677T 基因型及等位基因分布頻率(n,%)

2.3 MTHFR A1298C 基因型及等位基因分布頻率差異 病例組與對照組MTHFR A1298C 3 種基因型分布頻率(AA、AC 和CC)以及突變C 等位基因分布頻率差異均無統計學意義(均P＞0.05)，見表3。

2.4 MTHFR C677T 基因多態性與UHA 的關系MTHFR C677T 的3 種基因型分布頻率(CC、CT、TT)組間兩兩對比，結果顯示，基因型CT 與CC 組間差異有統計學意義(P＜0.05)；基因型TT 與CC 組間差異有統計學意義(P＜0.05)；CT 與TT 組間差異無統計學意義(P＞0.05)。通過Pearson 相關性分析，TT基因型分布頻率與UHA 的發生存在顯著關聯，基因型TT、等位基因T 是UHA 發生的風險因素(OR＞1,P＜0.05)，見表4。

3 討論

MTHFR 參與體內葉酸和同型半胱氨酸的代謝，與DNA、RNA 和嘌呤的合成密切相關。正常酶活性的MTHFR 有助于維持體內同型半胱氨酸水平，對細胞分裂、胚胎發育和早期妊娠都有重要作用[7-8]。MTHFR基因易突變，基因多態性使酶的不穩定性增加，酶活性下降。常見的多態性是MTHFR C677T(rs1801133)和MTHFR A1298C(rs1801131)。C677T 多態性是核苷酸677 位的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)所取代，導致基因編碼的丙氨酸突變為纈氨酸，形成了CC、CT 和TT 3 種基因型，其中677CT 使MTHFR 酶的活性降低35%，677TT 則降低70%[4,9]。A1298C 多態性是1 298處腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)所取代，導致谷氨酸突變為丙氨酸，形成了AA、AC 和CC 3 種基因型，其突變型使酶活性降低程度較C677T 突變弱[10]。研究[11]表明，C677T 突變型CT 與TT，A1298C 突變型AC 與CC 不僅與MTHFR 酶活性減低有關，同時可引起葉酸代謝障礙，血漿葉酸水平顯著降低，誘發高同型半胱氨酸血癥。而妊娠期血漿總同型半胱氨酸升高可導致孕婦絨毛膜絨毛血管形成缺陷，誘發滋養層細胞凋亡，此外也可誘導血管纖維化，改變凝血途徑，增強血小板活化形成血栓，最終導致胎盤梗死和流產的發生[12-13]。目前，MTHFR 基因的多態性已被證實是神經系統疾病和精神疾病/障礙的風險因素，如增加神經管缺陷、唐氏綜合征、遲發型阿爾茨海默病[14-15]等的發生。R.R.NAIR 等[16]研究顯示，MTHFR C677T 多態性的TT 型使早期HA 發生的風險增加6.30 倍，雜合突變型(CT)使風險增加1.96 倍；其指出MTHFR 677C＞T 多態性可作為北印度人群流產的早期遺傳篩查指標。但在埃及女性[17]和日本女性[18]的研究結果中，與對照組相比，病例組的TT 基因型分布頻率較高，但差異并無統計學意義。因此，MTHFR 基因多態性與UHA 的相關性仍存在一定的爭議。

在本研究中，MTHFR C677T 多態性對照組CC(野生型)基因型分布頻率和等位基因C 分布頻率均高于病例組，而病例組TT(純合突變)基因型分布頻率明顯高于對照組。經Pearson 相關性分析發現MTHFR C677T 位點的等位基因T 與UHA 發病有關，等位基因T(P=0.005,OR=1.532,95%CI: 1.138～2.063)與基因型TT(P=0.005,OR=2.393,95%CI:1.290～4.439)可增加UHA 的發病風險。以上結果表明MTHFR C677T 的突變T 基因可能是UHA 的遺傳危險因素之一。這與Y.L.CAO 等[4,19]的研究結果相符。此外，對兩組MTHFR A1298C 多態性的分布以及突變的基因頻率進行了分析，結果顯示病例組AC、CC、等位基因C 與對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，表明攜帶MTHFR 1298C 基因與UHA 發生沒有顯著關聯。中國人群MTHFR 基因多態性分布差異大，需根據不同區域，不同基因分布給予個體精準化的治療。同時，甲硫氨酸還原酶(5-methyltetrahydrofolatehomocysteine methyltransferase reductase,MTRR)基因多態性也是造成葉酸代謝異常，引起自然流產的關鍵酶之一，今后的研究將結合MTHFR 與MTRR 基因多態性綜合分析。

綜上所述，MTHFR 677 位點的T 突變可增加UHA 發生的風險，1 298 位點的C 突變與UHA 無明顯關聯。建議對蘇州地區孕齡女性開展常規MTHFR基因多態位點的遺傳篩查，在孕早期發現攜帶MTHFR 677T 基因型，及早干預并制定精準的治療方案對預防UHA 的發生具有十分重要的臨床意義。