白藜蘆醇對5/6 腎切除大鼠肌肉萎縮的保護作用及相關機制*

王蕤婷，李 璐，宮海鳳，張玲玲，黃新忠*

(南通大學附屬醫院腎內科，南通 226001)

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)現已成為一個全球性公共衛生問題，在接受血液透析的終末期腎病患者中有20%～55%出現肌肉萎縮[1]。肌肉萎縮是指骨骼肌體積和同齡人或自身肌肉以前的狀態相比出現下降，導致肉眼或影像學檢查可見肌肉縮小的一種疾病[2]。CKD 患者隨著病情進展，會出現肌肉萎縮及相關并發癥，如肌肉疼痛、無力、疲勞及運動耐力下降等，同時骨折和跌倒的風險也顯著升高，大大降低了患者的生活質量及生存率。

肌肉萎縮是一個涉及信號通路和萎縮相關基因轉錄控制的過程，正常人體內肌節功能的維持主要有3 個蛋白水解系統，分別為胞質鈣蛋白酶系統、泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)及自噬-溶酶體系統。肌原纖維蛋白降解需要三類酶的協調作用，其中最主要的就是E3 泛素連接酶[3]。肌肉環狀脂蛋白-1(musclering finger-1,MuRF-1)由353 個氨基酸殘基組成，包含1 個典型的N 末端環結構域，該結構域是肌肉特異性E3 泛素連接酶之一，在CKD的萎縮肌肉中高度表達，可通過UPS 增加肌肉蛋白水解，促進肌肉萎縮的發生[4]。肌肉萎縮蛋白-1(MAFbx,又名Atrogin-1)也是在骨骼肌中高度表達的E3泛素連接酶之一，指導蛋白質的多泛素化，通過26S蛋白酶體將肌肉蛋白進行水解，發生肌肉萎縮[5]。肌肉生長抑制素(Myostatin)也稱為生長和分化因子-8(growth and differentiation factor-8,GDF-8)，是分泌型生長因子TGF-β 超家族的成員，是現知的肌肉質量負性調節因子，在TGF-β 超家族中具有獨特性，幾乎只表達于骨骼肌譜系[6]。肌營養不良蛋白(dystrophin)是肌肉細胞中一種關鍵的細胞骨架結構蛋白，位于肌纖維中肌膜的內層，可連接細胞內區域與細胞外基質蛋白，增加肌膜連接處穩定性[7]，保護肌纖維在收縮期間保持穩定[8]。Dystrophin 表達的減少或合成的提前會使肌膜連接處穩定性下降，誘導肌肉萎縮的發生，如單基因遺傳疾病杜氏營養不良[9]。同時，功能性dystrophin的缺失也會誘導肌纖維膜脆弱，導致進行性肌肉變性，誘導肌萎縮[10]。研究[11]表明，dystrophin 在穩定肌膜及對抗肌肉收縮與拉伸中具有關鍵作用。

白藜蘆醇(resveratrol,RSV)又名芪三酚，也稱為3,4',5-三羥基二苯乙烯，是一種天然的非黃酮類化合物[12]。已證實，RSV 可預防和減緩多種疾病的進展，如通過調節轉錄因子和控制小RNA 的表達表現出抗腫瘤的作用。同時，也是潛在的抗衰老劑，可延緩各種生物體的壽命。RSV 其他作用還包括：保護心臟、調節雌激素受體、預防皮膚癌、抗炎性細胞因子、調節免疫等[13]。但其是否能緩解CKD 肌肉萎縮目前尚未見報道。本研究旨在揭示RSV 對5/6 腎切除大鼠腎功能、腎臟組織結構及肌肉纖維的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血清肌酐(serum creatinine,SCr)檢測試劑盒、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測試劑盒(重慶Biostec)；Masson 三色染色試劑盒、過碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色液、HE 染色液(北京Solarbio)；dystrophin 單克隆抗體、Atrogin-1單克隆抗體、MuRF-1 單克隆抗體、Myostatin 單克隆抗體(美國Santa Cruz)；兔抗大鼠GAPDH 單克隆抗體(英國Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建 于南通大學實驗動物中心采購雄性6～8 周的健康Sprague-Dawley 大鼠(200～220 g)30 只，隨機分成對照組(Sham 組,n=10)、5/6 腎切除組(Nx 組,n=10)、5/6 腎切除+RSV 干預組(Nx+RSV組,n=10)。動物實驗獲南通大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號：SYXK(蘇)2022-0046)。按照兩步法進行CKD 模型構建：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔內注射進行麻醉，在大鼠右肋下脊直肌外側剪開皮膚及肌肉，暴露腎臟，分別在腎臟上、下兩極切除右腎的2/3，隨后逐層縫合，然后常規飼養。1 周后剪開左側背部皮膚暴露左側腎臟，結扎腎蒂，切除整個左側腎臟。Sham 組采用相同的步驟進行手術，未切除腎臟。術后1 周開始予20 mg/(kg·d)RSV 灌胃。術后12 周處死大鼠，收集血液檢測腎功能，取腎臟組織切片行病理分析，取脛骨前肌行HE 染色、免疫組織化學及Western Blot 分析。

1.2.2 生化指標測定 大鼠腎功能中SCr、BUN 的測定用ELISA 定量試劑盒，經全自動生化分析儀測定(Modular)。

1.2.3 PAS 染色和Masson 染色 大鼠腎臟組織取出后立即固定于4%多聚甲醛中，進行石蠟包埋，切成3 mm 薄片進行PAS 染色和Masson 染色，然后光鏡觀察腎臟結構變化。采用半定量分析法計算腎臟腎小球硬化指數(glomerular sclerosis index,GSI)及腎小管間質纖維化指數(tubulointerstitial fibrosis index,TFI)。隨機挑選每張切片中20 個不重疊視野進行觀察。對腎小球硬化程度劃分為5 級：0 級，基本正常；1 級，腎小球硬化面積1%～25%；2 級，＞25%～50%；3級，＞50%～75%；4 級，＞75%～100%。GSI=(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/每張切片腎小球的總數，nx為腎小球硬化的個數。對腎小管間質纖維化程度也劃分為5 級：0 級，所有腎間質均正常；1 級，間質內基質沉積面積＜25%；2 級，基質沉積面積25%～50%；3 級，基質沉積面積＞50%～75%；4 級，基質沉積面積＞75%～100%。TFI=(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/(n0+n1+n2+n3+n4)，nx為不同纖維化程度視野的數量。

1.2.4 HE 染色 大鼠脛骨前肌組織在4%多聚甲醛中固定48 h，脫水后包埋在石蠟中，切成3 mm 薄片，脫蠟后用HE 染色，普通光鏡下觀察拍照，使用Image J 軟件評估平均肌纖維(cross-sectional area,CSA)。

1.2.5 免疫組織化學染色 大鼠脛骨前肌石蠟切片脫蠟后行常規抗原修復，用蛋白質封閉溶液封閉1 h，滴加一抗(dystrophin 單克隆抗體1∶300) 4 ℃過夜，二抗37 ℃30 min，普通光鏡下觀察大鼠脛骨前肌肌纖維形態及大小并攝片。

1.2.6 Western Blot 分析 冰上裂解動物腎臟組織和脛骨前肌肌肉組織用于提取蛋白，用BCA 試劑測定總蛋白濃度，20 μg 總蛋白上樣量以8%的凝膠電泳進行分離，冰浴下恒壓90 V 轉膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，用PBS 洗滌3 次，15 min/次，加一抗(Atrogin-1 單克隆抗體1∶1 000、MuRF-1 單克隆抗體1∶1 000、Myostatin 單克隆抗體1∶1 000、GAPDH單克隆抗體1∶5 000) 4 ℃過夜。與HRP 標記的二抗室溫孵育2 h 洗膜，用增強裂化學發光試劑(Millipore,WBKLS0100)進行曝光，利用灰度分析軟件Image J 進行定量分析，以目的蛋白與內參的灰度值比值計算各目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用Origin 2018 64 Bit 軟件進行統計分析和繪圖，所有數據以±s 表示。兩組間比較，正態分布采用t 檢驗。采用GraphPad Prism5.0 對多組數據進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV改善5/6 腎切除大鼠腎功能 ELISA 結果顯示，與Sham 組相比，從第2 周開始，Nx 組大鼠的腎功能開始下降，腎功能中SCr、BUN 水平明顯升高，進行RSV 干預后有所改善，見圖1。

圖1 5/6 腎切除大鼠腎功能變化

2.2 RSV 改善5/6 腎切除大鼠腎臟病理 PAS 染色和Masson 染色結果顯示，Sham 組大鼠腎臟組織學基本正常，Nx 組出現了明顯的腎小球硬化、間質纖維化及炎性細胞浸潤，RSV 干預后上述異常有所改善。此外，Nx 組大鼠GSI 及TFI 明顯增高，RSV 干預有所下降，見圖2。

圖2 5/6 腎切除大鼠腎組織病理及相關指數變化

2.3 RSV 改善5/6 腎切除大鼠肌肉萎縮 HE 染色顯示，Nx 組出現肌纖維紊亂，肌纖維橫截面積縮小，RSV 干預后肌纖維橫截面積增加；免疫組織化學染色結果顯示，Nx 組脛骨前肌dystrophin 的表達減少，RSV 干預增加了dystrophin 表達，見圖3。

圖3 5/6 腎切除大鼠肌肉纖維變化和dystrophin 表達情況

2.4 RSV 對5/6 腎切除大鼠Atrogin-1、MuRF-1 及Myostatin 的影響 Western Blot 分析顯示，與Sham組相比，Nx 組大鼠肌肉中萎縮相關Atrogin-1、MuRF-1 及Myostatin 蛋白表達明顯增加，RSV 干預表達降低，見圖4。

3 討論

CKD 在疾病進展過程中往往會伴有肌肉體積縮小、肌肉力量下降等。多年來，國內外學者一直致力于CKD 肌肉萎縮發病機制的研究。X.Y.LIU 等[14]在小鼠成肌細胞中發現，一種新型的叉頭轉錄因子(forkhead transcription factors,FoxOs)調節因子小C 末端結構域核磷酸酶4(the small C-terminal domain phosphatase 4,SCP4)可通過調節FoxOs 的磷酸化，增加其核內聚集，上調Atrogin-1 及MuRF-1 的表達，激活UPS 系統，增加溶酶體介導的蛋白水解，導致CKD肌萎縮。L.J.SUN 等[15]發現，在CKD 小鼠體內萎縮相關的長非編碼RNA-1(又稱Atrolnc-1)高度表達，高表達的Atrolnc-1 可激活NF-κB，上調MuRF-1，誘導肌肉萎縮。此外，CKD 肌萎縮還與鈣磷代謝紊亂、維生素D 缺乏、炎性因子增加及運動減少等有關。本研究結果顯示，Nx 組大鼠術后血清SCr、BUN 水平升高，腎臟組織中GSI 及TFI 表達增多，脛骨前肌中CSA 縮小，dystrophin 表達減少，Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表達增加，說明成功制備了5/6 腎切除CKD大鼠肌肉萎縮模型。

RSV 是一種常見的植物抗毒素，存在于一些食材中，如葡萄皮、花生和紅酒等。據報道，RSV 存在多個靶點，如沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,Sirt1)、腺苷酸單磷酸鹽(adenosine monophosphate,AMP)、腺苷酸激活蛋白激酶和NF-κB 等[16]。RSV 可通過上述靶點對血管的粥樣硬化、高血壓、腦卒中、心力衰竭及肌肉萎縮產生保護作用。在糖尿病小鼠肌肉骨骼肌中，RSV 可通過減少泛素及MuRF-1 的表達，下調caspase-3，增加骨骼肌強度及骨骼肌功能，緩解肌肉萎縮[17]。在惡性腫瘤小鼠骨骼肌和心肌中，RSV 可通過抑制NF-κB 的活性，緩解惡性腫瘤誘導的肌肉及心肌萎縮[18]。本研究中與Nx 組比較，Nx+RSV 組大鼠的SCr、BUN、GSI、TFI 表達均減少，脛骨前肌中CSA 增大，dystrophin 表達升高，Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表達均下降，說明RSV 對CKD 大鼠的腎臟和肌肉具有顯著的保護作用。

綜上所述，RSV 干預可改善5/6 腎切除大鼠腎功能及肌肉萎縮，其作用機制可能與上調dystrophin，降低Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表達有關。提示RSV 有望成為臨床上治療CKD 患者腎功能及肌肉萎縮的有效藥物，其更詳細的機制還需進一步研究，為CKD 肌肉萎縮的治療提供幫助。