2021 年南通市某養老機構胃腸炎暴發疫情中諾如病毒分子分型分析*

陳 璐，季霄雷，虞 瑩

(江蘇省南通市疾病預防控制中心微生物檢驗科，南通 226007)

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是一種無包膜單股正鏈RNA 病毒，可以通過污染的水或食物傳播，極微量的病毒顆粒(約100 個)即可發生感染[1]，是引起人類急性非細菌性胃腸炎的主要病原體，約50%的急性胃腸炎由該病毒引起[2]。其基因組全長7 000～7 700 bp，包括3 個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)：ORF1 編碼包括依賴RNA 的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)在內的非結構蛋白；ORF2 編碼主要衣殼蛋白VP1；ORF3編碼次要衣殼蛋白VP2[3]。根據VP1 區全基因組核苷酸序列的不同，可將其分為5 個基因組，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人類，GⅡ感染最常見，而GⅡ.4一直是病毒性胃腸炎的主要基因型[4]。

2021 年2 月，南通市某養老機構發生一起急性胃腸炎暴發疫情，多名患者及工作人員出現惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等胃腸道癥狀，通過現場流行病學調查，結合實驗室檢測結果，證實是由諾如病毒重組株感染引起的。本研究通過核酸檢測，核酸擴增，測序和進化分析，了解南通地區諾如病毒流行的分子分型，為今后的疫情防控提供資料。

1 對象與方法

1.1 標本來源 使用含無菌保存液的病毒采樣管，采集發病患者肛拭子20 份，為查找傳染源，同時采集無癥狀工作人員肛拭子10 份。無菌采樣后均置于病毒保存管內冷鏈條件下4 h 送檢南通市疾病預防控制中心實驗室。

1.2 標本處理和核酸提取 送到即檢，將標本充分渦旋振蕩后離心，取上清液300 μL，使用上海之江全自動核酸提取儀(型號：EX 3600)和上海之江核酸提取試劑(批號：P20210106)提取核酸RNA，洗脫液為60 μL，-20 ℃保存備用。

1.3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 檢測 使用中山達安諾如病毒核酸測定試劑盒(批號：20201202)，按照試劑盒說明書配置反應體系(25 μL)，檢測儀器是ABI 7500 PCR 儀，反應條件為：50 ℃，15 min；95 ℃，15 min；94 ℃，15 s，55 ℃，45 s，40 個循環。循環數≤38，曲線呈S 型且有明顯指數增長的判讀為陽性。

1.4 目的基因擴增與測序 采用可同時擴增RdRp區和VP1 區的正向引物Mon431：5'-TGGACIAGRGGICCYAAYCA-3'，反向引物G2-SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'。逆轉錄PCR 使用上海生工Takara One-step RT-PCR 試劑盒(型號：RR055)一步法擴增諾如特征基因RdRp/VP1 區基因片段，目的片段長度為557 bp，擴增反應條件為：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 min，65 ℃30 min，72 ℃1 min，35 個循環。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將有陽性條帶的產物送上海生工生物科技有限公司測序。

1.5 序列分析 將所測序列提交諾如病毒基因分型網站，獲得其基因型別。再與GenBank 中的諾如病毒參考序列進行比對，Blast 尋找相似度最高的序列，使用MEGA 7.0 軟件中的neighor-joining(NJ)-P距離法構建系統發育樹，分析采用1 000 個序列組。

2 結果

2.1 疫情概況 本起暴發疫情發生地為南通市某養老機構，人員相對密集，暴發時間為2021 年2 月。首發病例為調查前1 d(2021 年2 月2 日)14:00 左右，其余病例的發病時間集中在17:00～20:00 時，年齡跨度比較大，59～104 歲，平均(80±20)歲，均為中老年人；男8 例，女12 例；其中合并糖尿病18 例，高血壓16 例，高血脂15 例，免疫力較差，生活習慣不良。

2.2 諾如病毒檢出結果 通過RT-qPCR 檢測，諾如病毒陽性檢出率為83.3%(25/30)，且均為GⅡ，其中患者檢出率為100.0%(20/20)，無癥狀工作人員為50.0%(5/10)。選取Ct 值≤30 的20 份標本，提取的核酸經普通RT-PCR 擴增后，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，18 份標本在557 bp 處可見特異性片段，大小與預期相符，部分擴增陽性標本見圖1。

圖1 部分擴增陽性條帶

2.3 序列分析和系統進化樹分析 將RT-qPCR 檢出的18 份標本的產物進行測序，測序成功16 條，諾如病毒在線分型工具結果顯示引起此次疫情暴發的型別有兩種：GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012(68.75%，11/16)和GⅡ.3-GⅡ.P12(31.25%，5/16)；同源性分析發現，各條序列間核苷酸同源性高達98%。將16 條序列與從GenBank 數據庫下載的諾如病毒參考株進行比對，分別建立RdRp 區和VP1 區進化樹，表明11 條GⅡ.P16 與MT501844.1(西班牙株)同源性較高，屬于同一個進化分支，5 條GⅡ.P12 與MT127358.1 GⅡ(韓國株)處于同一分支，親緣性較高，見圖2；11條GⅡ.4 Sydney2012 與MW205667.1(北京株)同源性較高；5 條GⅡ.3 與MH842259.1(浙江臺州株)處在同一分支，見圖3。

圖2 南通地區16 株諾如病毒與10 條參考株(國外)RdRp 區進化樹

圖3 南通地區16 株諾如病毒與10 條參考株(國內)VP1 區進化樹

3 討論

諾如病毒主要通過糞口途徑傳播，傳染性極強，主要發生在人口密集的公共場所或半封閉環境，如學校、養老院、托幼機構。全年均可發病，但具有較明顯的季節性，寒冷季節高發，因此又被稱為“冬季嘔吐病”，北半球高發時間為10 月～次年3 月，南半球是4～9 月。人群普遍易感，可累及任何年齡，尤其是免疫力低的兒童和老年人?；颊?、隱型感染者、健康帶菌者均可成為傳染源。此次諾如病毒暴發疫情，經現場流行病學調查，排除水源性和食源性感染的可能，考慮傳播方式為人與人近距離接觸和氣溶膠傳播。由該病毒導致的急性胃腸炎多呈自限性，成人多數表現為腹瀉，兒童表現為嘔吐。

在眾多的基因型中，GⅡ.4 依靠自身較強的變異能力以及高變區位于病毒衣殼表面多變的免疫識別受體相互作用的功能，屬于Nov 優勢基因型，其不同的變異亞型在各自的變異環境中具有更高的感染性[5]。該型別常引起世界范圍的大暴發，每隔2～3 年出現1 個新的變異株，并在世界范圍內引起大流行[6]。GⅡ.4 Sydney2012 是2012 年首次在澳大利亞悉尼被發現的，隨后在我國多省份被相繼報道并成為主要流行亞型，充分說明了GⅡ.4 全球流行的特點和持續突變的適應能力[7]。最近的研究[8-9]表明GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012 是由GⅡ.2 型和GⅡ.4 Sydney2012 株重組后形成的新的重組株，重組發生在GⅡ.P16 RdRp 基因。GⅡ.P16 在人群中具有低傳播的優勢，可以逃脫固有免疫而達到在人群中廣泛流行的目的[10]。

本次調查中，在采集的10 份無癥狀感染中檢出諾如病毒陽性5 份，基因型均為GⅡ.P12-GⅡ.3，但均未表現出明顯的胃腸道癥狀，這可能與中青年免疫力相對較強有關。GⅡ.P12-GⅡ.3 屬于常見的重組類型，在江蘇鎮江、無錫均有報道，是引起北京和武漢兒童腹瀉病檢測中最多的重組類型，分別占非GⅡ.4 重組類的54.2%和54.9%[11-12]。該型別主要出現在亞太地區，如日本、韓國、中國等[13]，本研究也發現了這種重組類型且與韓國株同源。GⅡ.3-GⅡ.P12毒株在2009—2015 年均有發現且多發生在青少年群體中。機構工作人員社會活動面廣，人員接觸多，流行病學調查時其中一名工作人員回憶后說自家小孩在數日前出現嘔吐、腹瀉癥狀，但未引起注意，也未有效處理嘔吐物導致自身感染，也是造成本重組株暴發的直接原因。

諾如病毒的基因組經常在ORF1 區和ORF2 區發生重組，這導致諾如病毒的遺傳分化更大，因此，RdRp 和衣殼蛋白的基因型可能因重組而不同。諾如病毒易變異，存在多種抗原類型和基因型，出現的重組株更表現出抗原的多樣性，易引起疫情暴發。2014年之前，全球范圍內諾如病毒暴發的基因型多為GⅡ.4 型，近年來主要流行亞型為GⅡ.4 Sydney2012，本次調查檢出11 條該型別且已經形成獨立的分支，未來很有可能繼續流行，應加強監測。

近年來，由諾如病毒引起的急性胃腸炎病例報道逐漸增多，這可能與諾如病毒抗原漂移和基因重組的方式進化有關[14]，本次測序結果顯示在一起暴發疫情中檢出兩種重組基因型，充分說明了諾如病毒變異頻繁的特點。

由諾如感染引起的急性暴發疫情多數是由于嘔吐物未得到及時有效的處理，造成氣溶膠傳播。本次調查的是發生在養老機構的暴發疫情，首例患者嘔吐后未第一時間消毒，而僅做簡單的清掃拖地處理，給病毒傳播創造了條件，同時也與老年人免疫力低下、衛生習慣不良以及環境封閉有關，應加強人員管理，減少流動，加強健康宣傳教育。