喹諾酮配合物材料的制備及其抗菌性能研究*

夏姣云,李瀟瀟,徐 彤,楊 燦

(長沙理工大學 化學化工學院,長沙 410114)

0 引 言

癌癥是現代致死率最高的流行病之一。據研究,所有癌癥中有近1/5的感染源都是微生物感染,因其感染而導致的各種疾病,都嚴重威脅著人類健康[1-5]。細菌感染可以用抗生素治愈,這對癌癥的預防也具有重要意義。金屬配合物作為有效藥物的廣泛使用,例如癌癥治療藥物[6]、抗炎藥[7]、降糖藥或抗菌劑和診斷劑[8-9],表明金屬離子的細胞毒性可以通過適當的配體選擇得到很好的控制。喹諾酮類是具有優異配合特性的合成化合物,可作為雙齒配體、單齒配體和橋聯配體與金屬離子結合形成配合物[10-12]。喹諾酮類藥物與金屬離子的相互作用,可以獲得許多與母體喹諾酮類化合物具有同等或更強的抗菌活性的金屬配合物[13-15]。鉑、釕、鈷、鈀、銅和其他d-嵌段金屬離子的配合物已在醫學上廣泛應用。但是鉑類抗癌藥物有很強的副作用,如周圍神經病變、脫發和患者的骨髓毒性等。因此研究人員致力于開發可提供不同作用模式和改善抗癌活性的替代金屬藥物,而銅離子異于鉑類化合物的特殊生物活性使其脫穎而出,銅很容易在還原態Cu(Ⅰ)和氧化態Cu(Ⅱ)之間循環,是生物系統、生命活動甚至生物細胞成分中不可或缺的重要元素[16-17]。銅配合物的抗腫瘤活性早在幾十年前就已被報道,許多新的配合物已顯示出巨大的抗菌、抗腫瘤潛力[18-20]。銅配合物可能比鉑類藥物的副作用相對較低,并被認為能夠克服順鉑的遺傳和獲得性耐藥性。本文選用喹諾酮類抗生素環丙沙星作為第一配體,苯并咪唑類化合物作為第二配體,通過微波輔助合成法合成新型三元銅配合物,并將銅配合物用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測試。研究結果表明,配合物與單一的喹諾酮類抗生素具有更強的抗菌活性。

1 實 驗

1.1 實驗原材料

5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑按照文獻[21]合成;牛肉膏蛋白胨培養基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、牛血清白蛋白(BSA)、溴化乙錠(EB)均為生化試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;小牛胸腺DNA：生化試劑,索萊寶生物技術有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)：生化試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;噻唑藍(MTT)：生化試劑,上海麥克林生化科技有限公司;環丙沙星、高氯酸銅六水合物,上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑為市售的分析試劑,實驗用水為去離子水。研究配合物與牛血清白蛋白作用時,底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L;研究配合物與牛血清白蛋白作用時,底液為含0.05 mol/L NaCl的pH值=7.2的Tris-HCl 緩沖溶液,配制的EB溶液和牛血清蛋白溶液濃度分別為1×10-3、3×10-6mol/L。

1.2 配合物的合成

取0.3313 g(1 mmol)環丙沙星溶于10 mL水中,并用等摩爾量的NaOH中和,再加入0.2416 g(1 mmol)Cu(NO3)2·3H2O,室溫攪拌,混合均勻。再將溶有0.2091 g(1 mmol)HPBM用30 mL乙醇溶解,再用(0.2 mol/L)NaOH 調節pH值至5～6,將混合溶液轉移至圓底燒瓶中,置于120 ℃油浴中,冷凝回流1.5 h,冷卻過濾,棄去淺綠色固體。濾液在室溫下放置,數周后有藍綠色晶體析出,乙醇重結晶,空氣中干燥后置于干燥器中保存。

圖1 化合物SF-Cu-HPBM結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the compound SF-Cu-HPBM structure

1.3 樣品的性能及表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)

通過FT-IR光譜儀分析樣品的分子結構和化學組分,Nicolet iS20型,上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3.2 元素分析儀(EA)

通過元素分析儀分析環丙沙星和SF-Cu-HPBM的元素組成和含量,Elementar UNICUBE型,德國元素-艾力蒙塔貿易(上海)有限公司。

1.3.3 紫外分光光度計(UV-Vis)

通過紫外分光光度計分析環丙沙星和SF-Cu-HPBM的光吸收性能以及與小牛胸腺DNA的作用,F7000型,日本日立公司。

1.3.4 高分辨質譜儀(ESI-MS)

通過ESI-MS測試SF-Cu-HPBM的組成,Waters G2-XS Qtof型,沃特世科技(美國)有限公司。

1.3.5 精密電導率儀

通過電導率儀分析化合物的電解質類型,MP515-03型,上海三信儀表廠。

1.3.6 熒光分光光度計

通過熒光分光光度計分析配合物與DNA結合的方式,F7000型,美國Millipore System (Biocel) 公司。

1.3.7 烏氏粘度計

通過烏氏粘度計分析配合物與DNA的作用,PH-010A 型,上海一恒科學儀器有限公司。

2 結果與討論

2.1 配合物表征

2.1.1 紅外光譜分析

室溫下,測定了配體環丙沙星、及配合物SF-Cu-HPBM在400～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜。喹諾酮為第一配體,苯并咪唑類為第二配體的紅外分析結果見表1,實驗結果表明：(1)SF-Cu-HPBM配合物分別在3 474.39 cm-1出現吸收峰,而環丙沙星配體中未出現,這歸因于配合物-NH2+的伸縮振動ν—NH2+及結合水的O-H伸縮振動峰ν—O—H。(2)環丙沙星在3 043.87 cm-1出現了吸收峰,這是哌嗪基上N—H的伸縮振動v—NH,而SF-Cu-HPBM配合物分別在2979.78 cm-1處出現了吸收峰,這是第二配體咪唑環上N-H的伸縮振動ν—NH。(3)環丙沙星在1 613.96 cm-1(νC=O)、1 498.28 cm-1(νC—OH)、1 372.60 cm-1(νas(COO—))三處表現強的吸收峰,這歸因于羧基的C=O伸縮振動、C—OH的伸縮振動和COO-的對稱伸縮振動。在配合物中并沒有出現—COO—的3個特征吸收峰,由于形成配合物,羧基峰特征峰向低波數方向位移,SF-Cu-HPBM配合物在1 627.25,1 461.83,1 292.23 cm-1處分別表現3個強吸收峰,分別歸屬于C=O的伸縮振動(νC=O)、—COO—的不對稱伸縮振動νas(COO—)和對稱伸縮振動νas(COO—),這意味著第一配體環丙沙星中的羧酸基團脫去了H離子,并通過COO-陰離子單齒與中心銅離子配位。(4)另外,SF-Cu-HPBM配合物在511.52、429.20 cm-1處分別表現的兩個吸收峰為Cu-O和Cu-N的伸縮振動,這進一步表明兩種配體均與中心銅離子發生了配位。

表1 苯并咪唑類配合物與配體的紅外特征峰Table 1 Infrared characteristic peaks of benzimidazole complexes and ligands

2.1.2 元素分析

元素分析是研究有機化合物中元素組成和含量的化學分析方法。根據比較理論與實際合成化合物中C、H、N 3種元素的百分含量,來分析化合物是否與預期一致。如表2所示,配合物中各元素的實驗測定值與計算值較為吻合,百分含量相差不大,與預期實驗結果一致。

表2 5種配合物的元素分析數據Table 2 Elemental analysis data of five complexes

2.1.3 紫外光譜分析

室溫下,測定了配合物的DMSO溶液(1×10-2～1×10-5mol/L)在200～450 nm和450～800 nm范圍內的紫外可見吸收光譜。如表3所示,配合物與配體的DMSO溶液在近紫外區283.00～284.50 nm和331.50～332.00 nm處均有2個較強的吸收峰,這是由于配體和配合物的π→π*躍遷。研究發現,配體和配合物最大吸收峰的位置并未發生改變,但吸收峰的強度卻有所減弱,這是由于金屬離子與配體配位后,氮原子的電子云密度的降低。其次,發現配合物在可見光區673.80 nm出現了配體中不含有的弱而寬的吸收峰,這是由于配合物分子中心Cu離子的d→d躍遷。

表3 配合物與配體的紫外光譜數據Table 3 UV spectral data of complexes and ligands

2.1.4 質譜分析

室溫下,測定了配合物乙腈溶液(1×10-5mol/L)的電噴霧質譜(ESI-MS)。如圖2,在SF-Cu-HPBM配合物的質譜圖中顯示,存在正離子峰m/z為604.39,推測配合物溶液中存在配離子[Cu(SF)(HPBM)]2+。

圖2 配合物的質譜圖Fig.2 Mass spectra of complexes

2.1.5 摩爾電導率

在室溫25 ℃下,測定配合物在甲醇和DMSO溶液中(1×10-3mol/L)的摩爾電導率分別為172.3和72.3 S·cm2/mol,配合物為1：2型電解質。

2.2 新型三元銅配合物的抗菌性能

2.2.1 最小抑菌濃度實驗

實驗測定了配合物與配體對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能,它們的體外活性數據如表4所示。實驗結果表明配合物的抗菌活性優于喹諾酮類抗生素配體的抑菌性能,第二配體HPBM的抑菌效果不是很明顯,而Cu(ClO4)2·6H2O也表現出優異的抑菌性能。配合物SF-Cu-HPBM與環丙沙星相比,大腸桿菌(0.098 μg/mL<0.178 μg/mL)和對金黃色葡萄球菌(0.102 μg/mL<0.425 μg/mL)都有更好的活性。

表4 配合物與配體的最小抑菌濃度MICTable 4 MIC of complexes and ligands

2.2.2 抑菌效果實驗

(1)平板涂布法

將配體、配合物藥液與菌液共同孵育4 h,平板涂布培養24 h后,各菌落的生長情況如圖3所示。實驗結果表明：(1)從圖3中可以看出,相比于空白組和陰性對照組,第一配體環丙沙星組的大腸桿菌菌落明顯減少,但是仍有一些菌落分布于固體培養基的四周,說明第一配體對于大腸桿菌具備一定的殺菌效果,且殺菌效果良好。第二配體HPBM沒有明顯的殺菌效果。而相較于第一配體,配合物SF-Cu-HPBM將所有細菌都殺死了,未長出任何菌落。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對大腸肝菌的抑菌性能明顯高于單一的喹諾酮抗生素;(2)從圖4中可以看出,相比于空白組和陰性對照組,環丙沙星組金黃色葡萄球菌菌落有所減弱,但抑菌效果不是很完全,HPBM配體也幾乎未顯現出抑菌性能,而合成的SF-Cu-HPBM配合物抑制了所有菌落的生長。因此喹諾酮類為第一配體、苯并咪唑類為第二配體的新型三元銅配合物對金黃色葡萄球菌也達到了很好的抑菌效果。

圖3 喹諾酮-銅-苯并咪唑類配合物、配體對大腸桿菌的生長情況的影響圖：(a)為空白對照組;(b)為陰性對照組;(c)為配體HPBM組;(d)為環丙沙星(SF)組;(e)為喹諾酮-銅-苯并咪唑類(SF-Cu-HPBM)組Fig.3 Effect of quinolone-copper-benzimidazolium complexes and ligands on the growth of E.coli Figure：(a) blank control group;(b) negative control group;(c) ligand HPBM group;(d) ciprofloxacin (SF) group;(e) quinolone-copper-benzimidazolium complex (SF-Cu-HPBM) group

(2)抑菌圈

采用濾紙片法研究了各配體及銅配合物(20 μg/mL)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,結果以抑菌圈直徑來表示。每個培養皿都放置了相應的配體與配合物,更直觀的比較配合這一作用方式,是否能夠在喹諾酮抗生素抗菌活性的基礎上得到提高。如圖5(a)和 (b)所示,明顯看出,配合物4位上的抑菌圈直徑明顯大于1位上的,抑菌效果明顯提高,與上述實驗結果一致。

2.3 新型三元銅配合物與DNA的相互作用

2.3.1 DNA紫外滴定分析

紫外滴定分析法應用廣泛,操作簡便,是探究生物大分子(DNA/蛋白質)與過渡金屬離子之間的相互作用的有力手段,不僅能夠判斷兩者之間的作用模式,還能夠準確地表征作用強度。當配合物與DNA作用,雙螺旋結構被破壞,則會產生增色效應;若配合物與DNA作用,而導致分子構象變化,則會產生紅移和減色效應,作用越強減色效果越明顯。

由圖6可知,配合物、配體與DNA作用均產生明顯的紅移和減色效應。這可能歸因于配合物插入DNA堿基對中,發生電子堆積,配合物作用配體的π*空軌道與堿基的π電子軌道發生耦合,能級下降,產生π→π*躍遷。如圖6(a)所示,隨著DNA濃度的升高,苯并咪唑類為第二配體的配合物SF-Cu-HPBM在277 nm處產生了33.66%的減色;如圖6(b)所示,環丙沙星在273.5 nm處產生了8.03%的減色效應。新型三元銅配合與DNA的作用明顯高于單一的喹諾酮類化合物。配合物、配體與DNA作用的大小為SF-Cu-HPBM>環丙沙星。配合物、配體與DNA作用的紫外光譜數據見表5。

圖6 配合物、配體與DNA相互作用的紫外光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(b)為SF與的DNA相互作用的紫外光譜圖;(a)(b)兩圖中,曲線1為游離的待測樣品的吸收曲線,曲線2-12為不同DNA濃度下的吸收光譜Fig.6 UV spectra of the interaction between the complexes,ligands and DNA：(a) the UV spectra of the interaction between SF-Cu-HPBM and the DNA;(b) the UV spectra of the interaction between SF and the DNA;(a) (b) in both figures,curve 1 is the absorption curve of the free sample to be tested,and curves 2-12 are the absorption spectra at different DNA concentrations

2.3.2 EB競爭實驗分析

溴化乙錠(EB)是一種因其物理性質和生物活性而被廣泛應用于分子生物學的熒光化合物。它是一種具有抗病毒特性的錐蟲染料,可插入核酸雙螺旋區域的相鄰堿基對之間。通過嵌入,EB的熒光量子產率顯著提高,它與DNA形成的體系在可見光區顯示出光學活性。當DNA-EB體系被DNA-待測物體系所替代,EB從DNA雙螺旋結構中游離出來,熒光被猝滅。利用這種方法進一步研究兩者之間的相互作用。

由圖7可知,在僅有待測樣品或DNA時,在332 nm的激發光下,580～600 nm處都沒有熒光產生。而DNA-EB體系在580～600 nm處顯示出熒光,這說明EB已經嵌入DNA的雙螺旋結構中。隨著待測樣品的不斷加入,DNA-EB體系的熒光強度明顯減弱,這說明了DNA-EB體系被DNA-待測物體系所替代,待測樣品與DNA很可能是通過經典插入模式相結合。

2.3.3 牛血清蛋白實驗分析

熒光分析是評價金屬配合物與牛血清白蛋白相互作用的一種有效方法。許多蛋白質的特征熒光都主要由色氨酸貢獻。在牛血清白蛋白中,熒光發射強度取決于兩個色氨酸側鏈134和212在極性溶劑中的暴露程度。銅配合物的加入能夠使BSA體系熒光產生規律性猝滅,觀察BSA最大發射峰的紅移或藍移現象,可以進一步分析待測樣品與BSA的作用關系。從圖8中可以看出,隨著配合物與配體的加入,BSA的熒光強度都發生了不同程度的猝滅。

圖8 配合物、配體與BSA作用的熒光譜圖：(a)為SF-Cu-HPBM與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配合物待測樣品濃度(濃度控制為10～150 μmol/L)的吸收曲線;(b)為SF與BSA作用的熒光譜圖,曲線1為BSA的熒光曲線,曲線2-8為向BSA中逐次加入等量DMSO溶解的配體待測樣品濃度(濃度控制為10-150 μmol/L)的吸收曲線Fig.8 Fluorescence spectra of the interaction between the ligands and BSA：(a) shows the fluorescence spectra of SF-Cu-HPBM with BSA,curve 1 shows the fluorescence curve of BSA,curves 2-8 show the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration control 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time;(b) shows the fluorescence spectra of SF with BSA fluorescence spectra,curve 1 is the fluorescence curve of BSA,and curves 2-8 are the absorption curves of the concentration of the ligand to be tested (concentration controlled as 10-150 μmol/L) by adding equal amount of DMSO to BSA one at a time

圖9和表6是配合物、配體與BSA相互作用的熒光變化趨勢和光譜數據,更直觀的闡明了各種化合物與BSA的作用強度。根據Stern-Volmer方程計算得出各種配合物、配體與BSA作用的Ksv,配合物與牛血清白蛋白的結合常數Ksv為2.36×105M-1,明顯高出第一配體環丙沙星與BSA的結合力3.85×103M-1,表明BSA在承擔藥物分子血液運輸等過程中,更易與配合物產生作用,抵達靶細胞。

表6 配合物、配體與BSA相互作用的熒光光譜數據Table 6 Fluorescence spectrum data of complexes,ligands and BSA interactions

圖9 不同濃度化合物下BSA體系熒光的變化趨勢Fig.9 Variation trend of fluorescence in BSA system under different concentrations of compounds

3 結 論

(1)成功合成了喹諾酮類抗生素環丙沙星為第一配體、苯并咪唑類化合物為第二配體的銅離子配合物。配合物可能的分子式為：[Cu(SF)(HPBM)](NO3)2·1.5H2O。

(2)結合紅外光譜、紫外光譜、電噴霧質譜、元素分析以及摩爾電導率的測試結果表明,喹諾酮類配體是通過4-位羰基氧原子、3-位羧基氧原子與銅離子配位,苯并咪唑類配體是通過芳香雜環上的兩個氮原子與銅離子配位,配合物性質穩定、性能優異。

(3)將新型三元銅配合物,用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性測試,發現配合物比單一的喹諾酮類抗生素具有更強的抗菌活性。

(4)通過研究新型三元銅配合物與小牛胸腺DNA的作用及DNA-EB競爭實驗,證明了配合物以經典插入模式與DNA結合。并且在牛血清蛋白實驗中,發現配合物與牛血清白蛋白(BSA)的結合常數為2.36×105M-1,第一配體環丙沙星與BSA的結常數為3.85×103M-1,明顯看出配合物與BSA的結合能力高于與配體與BSA的結合能力,表明BSA在承擔藥物分子血液運輸等過程中,更易與配合物產生作用,抵達靶細胞。