兔竇房結切片制作方法的探究和形態學特點的觀察

袁慧杰,潘昭良,袁廣明,馮煉強,陳大堤,秦麗娜

中山大學 中山醫學院,廣州 510080

竇房結(SAN)是心臟傳導系統的重要組成部分,位于上腔靜脈口與右心房交界處,在界溝上端的心外膜下,是心臟最高級的起搏組織[1-2]。竇房結由起搏細胞(P細胞)、過度細胞(T 細胞)、心肌細胞、心臟成纖維細胞等實質以及竇房結動脈、神經、血管和膠原、網狀、彈性纖維等間質共同組成[3]。由于竇房結組織不規則,形態不典型,不同種屬動物SAN位置變異多等因素,該類標本的取材和制作是難點。而標準、規范的組織學切片不僅是保證實驗教學質量的前提,對科研及臨床都是必不可少的[4]。本研究采用連續切片的方法獲得兔SAN 石蠟切片,并采用不同的染色方法對竇房結切片進行染色,經過多次實驗獲得了較滿意的染色效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭大白兔10只,雌雄不拘,3月齡,體質量2.5～3.0 kg,SPF級,由中山大學中山醫學院實驗動物中心提供。生產許可證號:SCXK(粵)2011-0029。飼養條件:實驗動物隨意進食、自由飲水,室內環境溫度在20～25 ℃,相對濕度35%～75%。動物實驗方案由中山大學倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑

組織包埋機(Thermo HISTOSTAR),石蠟切片機(LEICA RM2235,德國Leica公司),光學顯微鏡(Motic BA210Digital)。戊巴比妥鈉溶液(w=3%),多聚甲醛溶液(φ=4%),鹽酸酒精分化液(φ=1%),伊紅水溶液(w=0.5%),磷鉬酸溶液(w=1%),醋酸苯胺藍液(φ=2%),冰醋酸水溶液(φ=1%)。Harris蘇木素液,Bouin氏固定液,天青石藍液,Mayer蘇木精液,麗春紅酸性品紅溶液(以上溶液均為自備)[5]。

1.3 兔SAN組織取材和切片

取健康新西蘭大白兔,戊巴比妥鈉溶液(w=3%)以1 mL/kg的劑量進行靜脈注射麻醉,之后固定于兔臺上,從耳緣靜脈注入空氣栓塞致死,于胸前進行脫毛、消毒,后迅速剖開心腔,剪開心包,找到右上腔靜脈,用白色縫合線標記,取出完整心臟。然后將心室橫向剪去一半,用生理鹽水沖出心腔積液,剪開上、下腔靜脈,取上腔靜脈與右心房交界處的界溝組織,下至下腔靜脈口區域(即包括界溝組織與上、下腔靜脈根部)。將切取的兔SAN 組織標本迅速用多聚甲醛溶液(φ=4%)固定48 h,之后進行實驗室修塊。大小視組織形狀,按2 cm×2 cm×0.5 cm的原則置于包埋盒內,鉛筆寫上標志。多聚甲醛溶液(φ=4%)再固定一定時間后,用φ=70%、80%、90%、95%的乙醇及無水乙醇依次進行梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,用LEICA RM2235切片機進行連續切片,切片厚度5 μm。

1.4 SAN組織染色

每10張取1張切片進行HE染色,光學顯微鏡下觀察是否含有SAN 組織;取含有SAN 組織的陽性切片,每相鄰的2張切片為一組;一張進行常規HE染色,一張進行改良Masson三色染色;中性樹膠封固后,在光學顯微鏡下觀察。

1.4.1 兔SAN 組織HE染色

石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡脫蠟各10 min,再經過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ和φ=95%、90%的乙醇各浸泡5 min,φ=80%、70%的乙醇和蒸餾水各浸泡2 min水化;Harris蘇木素染色10 min使細胞核著色,自來水流水洗5 min藍化;鹽酸酒精分化液(φ=1%)分化數秒,分化后的切片再流水洗30

min反藍;之后將切片放入伊紅水溶液(w=0.5%)中染色5 min,蒸餾水稍洗;再經φ=70%、80%、90%的乙醇及無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ浸泡各2 min,進行上行梯度脫水;最后切片入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明處理各10 min,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察[6-7]。

1.4.2 兔SAN 組織改良Masson三色染色

石蠟切片經二甲苯、酒精等常規脫蠟至水化(參照HE染色);置入Bouin氏固定液室溫作用一晚進行媒染,然后流水沖洗至切片上的黃色消失;天青石藍液滴染2 min,蒸餾水稍洗1 min;Mayer蘇木精液滴染5 min,蒸餾水稍洗;鹽酸酒精分化液(φ=1%)分化3 s,流水沖洗10～20 min;麗春紅酸性品紅溶液滴染5 min,蒸餾水稍洗;磷鉬酸溶液(w=1%)處理5 min——根據需要可適當延長時間;甩去磷鉬酸溶液不洗,滴醋酸苯胺藍液(φ=2%)復染5 min;冰醋酸水溶液(φ=1%)處理2 min,去除上液;切片經φ=70%、80%、90%、95%的乙醇溶液脫水各5 s,再經無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水各10 s,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各2 min,中性樹膠固封,光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 兔SAN的位置及形態

根據兔SAN 的解剖學結構來定位取材,觀察連續切片。結果表明,兔SAN 主要位于上腔靜脈與右心房界溝的靜脈竇側,結的長軸與界溝平行。光學顯微鏡下觀察,兔心臟SAN 區域組織結構較為疏松,染色也比較淺淡,與周圍的心房肌等界限清晰、易于區分,且SAN 靠近心外膜,與心內膜之間隔以右心房的心肌而不直接相鄰(見圖1)。

圖1 兔SAN組織連續切片結果(改良Masson三色染色)

2.2 兔SAN動脈的形態學特點

竇房結中心有一條較粗的竇房結動脈,圍繞該動脈周圍的細小的肌纖維構成竇房結的主體。本實驗中的10例大白兔SAN 區均觀察到了SAN 動脈,為1～3條不等,動脈壁外膜含有豐富的膠原纖維,這使得SAN動脈壁顯著增厚,動脈壁膠原纖維與結內膠原纖維網相互連接,外圍常見P細胞、T細胞圍繞(見圖2)。

圖2 兔SAN內動脈和膠原纖維

2.3 兔SAN內的細胞類型和形態學特點

SAN內部主要由起搏細胞(P 細胞)、移行細胞(T 細胞)和少量心房肌細胞構成。P 細胞多位于SAN的中央,外形呈圓形、橢圓形或多邊形,散在或成群分布;細胞核大,約占細胞直徑的二分之一,多呈圓形或橢圓形,可見1～2各核仁;核周有空泡狀,胞漿透亮,染色淺淡,無肌紋。T 細胞又稱過渡細胞,數量較少,主要位于竇房結的外周,結的中央亦會有少量散在分布,其大小、形態、位置等均介于 P細胞與心房肌細胞之間,有中間過渡性質;T細胞多呈不規則長圓柱形,比一般心房肌細胞短,界限不清晰,核長形或橢圓形;細胞內含肌原纖維,偶見橫紋,染色也介于 P 細胞與心房肌細胞之間。普通心房肌細胞,主要位于心內膜側,為長柱形或長梭形,有明顯橫紋,胞核較長且位于細胞中央,胞漿染色較深(見圖3)。

圖3 兔SAN內的P細胞、T細胞、心肌細胞(HE染色)

2.4 兔SAN間質的形態學特點

兔心臟SAN組織中還含有大量的膠原纖維和纖維細胞,膠原纖維與肌纖維的鑒別染色是病理特殊染色中的重要方法。Masson三色法染色結果顯示:兔SAN內部以藍色的膠原纖維為支架,交錯成網,各種細胞成分就散布于網狀支架的間隙中,胞核呈黑藍色。SAN動脈管壁也含有豐富的膠原纖維,使管壁增厚,這些膠原纖維與周圍組織中的膠原纖維網相互連接,將結細胞分隔成許多細胞群。在HE染色中除了細胞核藍染以外,所有組織均紅色,膠原纖維等成分不易觀察。而Masson三色染色中膠原纖維被苯胺藍染成藍色,肌纖維被酸性品紅染成紅色,胞核呈黑藍色,SAN中各結構分層、分類顯示,清晰明了(見圖2A)。

3 討論

兔心臟SAN 由于位置隱蔽,通過肉眼難以觀察,根據目前的文獻報道,不同種屬動物SAN 位置雖然有差異[8],但都位于心臟上腔靜脈和右心房的交界區域[9-12]。本實驗通過在體打結的方法標記右上腔靜脈,取兔心臟上腔靜脈與右心房交界處的界溝組織進行連續切片,成功獲得兔SAN 切片。說明上腔靜脈在體打結法能夠保證心臟離體后SAN定位的準確性,縮短取材的時間,而SAN 組織包埋于心肌組織中的特點也決定了只能通過連續切片才能獲得SAN切片。

本實驗通過HE染色和改良Masson三色染色法對兔SAN進行了形態學觀察。傳統HE染色能很好地顯示SAN各細胞結構,但是在HE染色中除了細胞核藍染以外,所有組織均紅色,膠原纖維等成分不易觀察。而改良Masson三色染色中,膠原纖維被苯胺藍染成藍色,肌纖維被酸性品紅染成紅色,胞核呈黑藍色,對于成分結構復雜的結締組織分層、分類顯示,紅藍相間,清晰明了,更好的顯示了SAN結構。兩種方法可相互補充,相互支持,對于兔SAN區的鑒定均具有重要的作用。

在改良Masson三色染色法中,采用天青石藍液和Mayer蘇木精液代替原本方法中的Weigert鐵蘇木精染液進行細胞核染色,該兩液穩定性好,染色效果佳,染液保存時間也更長。原法采用比布列西猩紅和伊紅混合液進行肌纖維染色,由于比布列西猩紅比較難購得,且用前需要過濾,本法用麗春紅酸性品紅溶液代替。磷鉬酸水溶液(w=1%)的作用一方面使染上紅色的膠原纖維分化成無色或淡紅色,而肌纖維、纖維素仍保持鮮紅,另一方面對膠原纖維又起媒染作用,使膠原纖維與大分子染料的苯胺藍液較易結合。苯胺藍液染色后用冰醋酸(φ=1%)處理,目的是除去附于原漿內的藍色,使染色鮮艷和清晰。用低濃度梯度酒精,代替三缸φ=95%的酒精,分色清悅,預防了因溶液交替更換所產生的破片龜裂、霧化之現象。

在兔SAN 形態學結構方面,與其他哺乳動物SAN成分的報道也基本一致[13-15]。主要由SAN 動脈、P細胞、T細胞、少量心房肌細胞以及包裹在動脈和細胞周圍的結締組織等構成。找到SAN 動脈是SAN定位的關鍵因素,結內的各種細胞成分形態也有明顯區分,P細胞最小、核大,胞漿透亮且染色最淺;心肌細胞細長,有橫紋,染色最深;T細胞主要位于結的外圍區,形態,染色深淺均介于P細胞和心肌細胞之間。

綜上所述,本方法能夠準確的得到兔SAN 切片并且很好觀察兔SAN 的不同結構,填補了教學標本空白,適用于病理學、組織胚胎學等學科的教學,同時為研究多種因素對 SAN 的損傷奠定了可靠的技術保障,具有一定的推廣應用價值。